所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. 人血清杀菌活性依赖Vn的抗性分析
<ol>
	<li>从商业来源购买正常人血清（NHS）。制备玻璃粘连蛋白（vitronectin）或Vn耗竭血清（VDS），并向VDS中补充180 nM Vn，使其浓度相当于NHS中的Vn含量。</li>
	<li>将NHS在56 °C加热30分钟，以灭活补体蛋白，从而制备热灭活血清（HIS）。 
	注意： 本实验中血清的最佳浓度（5%）和孵育时间（15分钟）是针对流感嗜血杆菌f型（Haemophilus influenzae&#160; type f, Hif）通过实验确定的；其他细菌病原体的这些参数可能有所不同。</li>
	<li>将细菌（本实验中为Hif M10及其突变株Hif M10Δlph）培养至对数中期（OD600&#160; = 0.3）。在3,500 ×&#160;g&#160;条件下离心10分钟，收集菌体沉淀。</li>
	<li>用1体积的含右旋葡萄糖明胶巴比妥缓冲液（DGVB++；pH 7.3）重悬菌体沉淀，缓冲液中含2.5%（w/v）葡萄糖、2 mM氯化镁（MgCl2）、0.15 mM氯化钙（CaCl2）和0.1%（wt/vol）明胶。</li>
	<li>将1.5 × 103&#160;菌落形成单位（CFU）的细菌加入含5%血清（NHS、HIS、VDS或VDS+180 nM Vn）的100 µL DGVB++&#160;中。在37 °C、300 rpm振荡条件下孵育15分钟。</li>
	<li>分别在0分钟（T0&#160;样本）和15分钟（Tt&#160;样本）时从反应体系中取出10 µL等分试样，涂布于巧克力琼脂平板上。将平板在37 °C过夜培养。</li>
	<li>培养后，计数平板上出现的菌落数。使用以下公式计算细菌杀灭百分比：&#160;（Tt时的菌落形成单位，即CFU）/（T0时的CFU）× 100。</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 mL 聚苯乙烯圆底试管&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-478</td>
			<td>12 × 75 mm 带盖型号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正常人血清 (NHS)</td>
			<td>Complement Technology, Inc.</td>
			<td>NHS</td>
			<td>混合人血清</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钙 (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>明胶</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>适用于细胞培养</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血细胞计数板</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化镁 (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人血浆来源的玻璃粘连蛋白 (Vn)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V8379-50UG</td>
			<td>细胞培养级</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>摇床&#160;</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>STR6</td>
			<td>平台摇床</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

确定玻璃粘连蛋白在细菌抵抗人血清杀菌活性中的作用

来源：Singh, B. 等，<a href='https://app.jove.com/v/54653'>研究玻璃粘连蛋白在细菌黏附和血清抗性中作用的实验方法</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018)
本视频展示了维甲素（vitronectin）——一种人类血清糖蛋白——在细菌耐药性中的作用。血清中的抗体与细菌表面蛋白相互作用，激活补体蛋白并形成膜攻击复合物，导致细菌细胞裂解。维甲素与细菌膜蛋白结合后，可阻止膜攻击复合物的形成，从而使细菌得以存活。

来源：Singh, B. 等，研究玻璃粘连蛋白在细菌黏附和血清抗性中作用的实验方法。J. Vis. Exp. (2018)  
本视频……

为了研究玻璃粘连蛋白（一种人血清糖蛋白）对细菌的影响，首先准备含有流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）悬液的试管。
用含有玻连蛋白的正常人血清处理其中一支试管，另一支则用去除玻连蛋白的血清处理。这两种血清均含有抗体和多种补体蛋白——这对杀菌活性至关重要。
孵育期间，抗体与细菌表面蛋白相互作用，激活补体蛋白形成C5转化酶，后者裂解C5。C5b与C6结合，随后结合C7，形成C5b6-7复合物。该复合物结合至细菌细胞膜，并招募C8，形成C5b67-8复合物。
该过程促进C9单体的结合及其聚合，形成膜攻击复合物——一种成孔结构。这些孔道导致离子和水的内流，从而引起细菌裂解。
相比之下，在含有正常血清的试管中，玻璃粘连蛋白会结合到细菌表面的一种蛋白质，该蛋白质可与 C5b6-7 复合物及 C9 单体相互作用。这些相互作用阻止了 C8 的招募以及 C9 的聚合，从而抑制膜攻击复合物的形成，导致细菌得以存活。
从两支试管中分别取出细菌悬液，并接种到各自的琼脂平板上进行培养。
在含有玻璃连接蛋白的血清中，细菌菌落数量更高，证实了该蛋白在细菌抵抗人血清杀菌活性中的作用。 

为进行玻璃粘连蛋白依赖性抵抗人血清杀菌活性的分析，首先按照文本方案中所述培养并收集细菌。离心后，用1体积的葡萄糖明胶巴比妥缓冲液重悬细菌沉淀。然后将1,500 CFU的细菌加入含5%血清的100微升DGVB++中。
将样品在37摄氏度下振荡孵育15分钟，转速为300 RPM。分别在0分钟和15分钟时从反应混合物中取出10微升等分试样。将等分试样接种至巧克力琼脂平板上，并在37摄氏度下过夜培养。巧克力琼脂平板孵育结束后，计数平板上出现的菌落，并按照文本方案中所述方法计算被杀灭细菌的百分比。

determining-role-vitronectin-bacterial-resistance-to-bactericidal

Research

科研

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

免疫学

Immunopathology

免疫病理学

Assay and Analysis

测定与分析

Determining the Role of Vitronectin in Bacterial Resistance to Bactericidal Activity of Human Serum

确定玻连蛋白在细菌对人血清杀菌活性的耐药性中的作用

640 次观看. 为了研究玻连蛋白（一种人类血清糖蛋白）对细菌的影响，首先是含有流感嗜血杆菌混悬液的试管。 用含有玻连蛋白的正常人血清处理一根管，用玻连蛋白耗尽的血清处理另一根管。两种血清变体都含有抗体和各种补体蛋白——这对杀菌活性至关重要。 在孵育过程中，抗体与细菌表面蛋白相互作用，激活补体蛋白形成 C5 转化酶，从而裂解 C5。C5b 与 C...

确定玻璃粘连蛋白在细菌抵抗人血清杀菌活性中的作用

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姓名	公司	目录编号	评论
6 mL 聚苯乙烯圆底试管	VWR	89000-478	12 × 75 mm 带盖型号
正常人血清 (NHS)	Complement Technology, Inc.	NHS	混合人血清
氯化钙 (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
明胶	Sigma-Aldrich	G9391	适用于细胞培养
血细胞计数板	Marienfeld	640210
氯化镁 (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266-1KG
人血浆来源的玻璃粘连蛋白 (Vn)	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	细胞培养级
摇床	Stuart Scientific	STR6	平台摇床