一种用于在离体条件下研究HIV致病机制的人宫颈黏膜感染模型

摘要

来源：Introini, A., 等 离体 人免疫缺陷病毒1型感染人淋巴组织和女性生殖道黏膜及组织培养 J. Vis. Exp. (2018).

本视频展示了利用人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）对人类子宫黏膜组织进行离体（ex vivo）感染，并将组织置于明胶海绵上于气液界面进行培养的方法。该方法可用于监测HIV-1在人体组织内的复制过程及致病机制。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 子宫颈黏膜的解剖与感染

注意：为获得最佳结果，宫颈黏膜外植体应在手术后尽快进行处理和感染，最好在手术当天进行。或者，标本可置于含抗生素的培养基（CMT）中，于4°C下浸没保存过夜，并在解剖后立即进行感染。

1. 让完全培养基（CM）充分平衡至室温，或将其置于预热至 37°C 的水浴中。使用前向完全培养基中添加抗生素溶液（CMT）。剩余的抗生素溶液应丢弃。将 70% 乙醇溶液倒入洁净容器中，用于在解剖过程中随时浸泡镊子和手术刀。在处理不同供体的样本之间，需清洁工具并更换手术刀刀片。
2. 使用无菌镊子将样本从运输容器转移至含有 10–20 mL CMT 的 100 mm 培养皿中。
3. 使用培养皿的盖子作为切割面进行组织解剖。用镊子轻轻夹住组织，用手术刀和刀片将宫颈外口和/或宫颈内口的黏膜层与下方的间质及肌层组织（黏膜下层）分离，以获得黏膜条。
   注意：在处理一块组织时，必须将其他组织保持浸没在培养基中，以防止组织干燥。
4. 将黏膜切成宽度为 2 mm 的条状，并尽可能去除和丢弃黏膜下层，仅保留约 2 mm 厚的组织层。再将条状组织切成 2 mm 厚的组织块，最终得到体积约为 8 mm³ 的组织外植块。
   警告：使用锐器处理人源样本会增加受伤和污染的风险。操作者应考虑佩戴金属网或防切割手套以提供额外保护。
5. 将组织外植块转移至新的含有 10–20 mL CMT 的 100 mm 培养皿中，以防止在继续解剖过程中组织干燥。解剖结束后，轻轻摇晃培养皿使外植块分布均匀。
6. 使用无菌镊子将外植块转移至无菌的 1.5 mL 圆底离心管中（每管最多放置 16 个外植块）。用移液器吸除管中的培养基。
7. 在 37 °C 水浴中解冻 HIV-1 病毒储备液。如有必要，用完全培养基稀释病毒原液。将病毒加入含有外植块的离心管中。剩余的病毒制剂应丢弃。
   注意：病毒原液应稀释至所选接种量至少包含在 0.5 mL 的体积中（表 1）。为减少独立实验之间的结果差异，整个研究应使用同一批次的病毒制剂（材料表）。
8. 将离心管放入恒温振荡器中，在 37°C、300 rpm 条件下孵育 2 小时。每隔 30–60 分钟轻轻翻转离心管数次。
   注意：为实现高效感染，从解冻 HIV-1 病毒制剂到将离心管转移至 37 °C 环境之间的时间应尽可能最短。
9. 向 6 孔板中每孔加入 3–4 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。HIV-1 感染孵育结束后，用移液器将离心管中的全部病毒制剂弃入含消毒液的容器中。用镊子将外植块转移至含有 PBS 的 6 孔板中。
10. 让外植块在室温 PBS 中静置 1 分钟，然后用移液器轻柔地将孔内 PBS 上下吹打 2–3 次进行洗涤。用移液器将 PBS 弃入含消毒液的容器中。向每孔加入 3–4 mL 新鲜 PBS。重复上述洗涤步骤共三次。在将外植块转移至海绵前立即弃去 PBS，以防止组织干燥。
    注意：宫颈黏膜外植块，尤其是宫颈内口组织，在感染过程中会释放大量黏液。彻底洗涤并尽可能去除黏液至关重要，因为黏液可能非特异性地滞留病毒，并在后续培养上清中释放，从而掩盖病毒复制信号。
11. 用镊子将每块明胶海绵上放置 5–8 个外植块，置于 12 孔板中。将板放回培养箱继续孵育。
12. 根据机构关于处理危险生物材料的规定及特定风险评估，将所有生物废弃物分别投入指定的废弃物容器中处理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gelfoam 12-7 mm 可吸收明胶海绵	Pfizer	NDC: 0009-0315-08	Gelfoam 和 Spongostan 在扁桃体和宫颈组织的组织培养中表现相当。
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm 可吸收止血明胶海绵	Ferrosan Medical Devices	MS0002	Gelfoam 和 Spongostan 在扁桃体和宫颈组织的组织培养中表现相当。
含酚红和谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基	ThermoFisher Scientific	21875034	在 RPMI1640 中加入 MEM 非必需氨基酸、丙酮酸钠、庆大霉素、两性霉素 B 和 15% (v/v) 胎牛血清 (FBS)，配制成培养液 (CM)。
无钙、无镁、无酚红的无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4			用于手术标本的保存和运输。PBS 可替换为其他具有生理 pH 的等渗溶液。培养液最适合过夜保存。
无菌细胞培养级水
70% 乙醇溶液
用于生物废弃物处理的消毒液
无菌金属镊子或尖头镊
无菌金属剪刀
无菌平头金属称量勺
无菌手术刀及刀片
6 孔细胞培养板
无菌培养皿，100 mm × 20 mm
无细胞 HIV-1 病毒制备物 HIV-1BaL	NIH AIDS 试剂计划	510	应扩增病毒以制备足够量的病毒储备液，用于多次实验。分装病毒悬液并储存于 -80 °C。避免反复冻融。
无细胞 HIV-1 病毒制备物 HIV-1LAI.04	NIH AIDS 试剂计划	2522	应扩增病毒以制备足够量的病毒储备液，用于多次实验。分装病毒悬液并储存于 -80 °C。避免反复冻融。
无菌 1.5 和 2 mL 螺口管
设定为 37 °C 的水浴锅
生物安全柜
干式恒温振荡器，配备适用于 1.5 mL 管的加热模块，设定为 37 °C、300 rpm