使用分泌型胚胎碱性磷酸酶报告基因检测法定量生物活性I型干扰素

摘要

来源：Bego, M. G. 等., 评估HIV-1感染的CD4细胞的天然感应功能⁺ 浆细胞样树突状细胞通过使用一种 离体 共培养系统 J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了使用 HEK-Blue 干扰素-α/β 报告细胞进行分泌型胚胎碱性磷酸酶检测，以定量浆细胞样树突状细胞在受到 HIV-1 感染的 CD4⁺ T 细胞刺激后所释放的 I 型干扰素（IFNs）。

方案

1. 使用 HEK-Blue IFN-α/β 报告细胞检测具有生物活性的 I 型干扰素。

注意：这些细胞是通过将人 STAT2 和 IRF9 基因稳定转染至 HEK293 细胞中而获得的，以构建完整的 I 型干扰素（IFN）信号通路。这些细胞还含有在 IFN-α/β 可诱导的 ISG54 启动子调控下的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因。用 I 型 IFN 刺激这些细胞可激活 JAK/STAT/ISGF3 通路，并诱导 SEAP 的产生。

1. 在添加10% FBS的DMEM中培养HEK-Blue IFN-α/β细胞。以每孔50,000个细胞的密度接种于平底96孔板中，终体积为180 µl。
2. 在U型底96孔板中，每孔加入220 µl外周血单个核细胞（PBMCs，稀释至850,000个细胞/ml）或220 µl浆细胞样树突状细胞（pDCs，浓度范围为100,000至500,000个细胞/ml），并与30 µl感染的T细胞（稀释至10⁶个细胞/ml）混合。
3. 将共培养物在37 °C、5% CO₂条件下孵育18–22小时，然后转移至V型底96孔板中。以400 × g离心5分钟。
4. 将20 µl共培养上清液加入平底96孔板的每个孔中，设复孔。每块板还需设置一组内部标准对照（人IFNα，终浓度为100 U/ml至2,500 U/ml）。将板在37 °C、5% CO₂条件下孵育18–22小时。
5. 使用QUANTI-Blue溶液检测碱性磷酸酶活性，该溶液在酶存在时由粉红色变为紫色/蓝色。按照生产商的推荐方法配制QUANTI-Blue溶液。向平底96孔板的每孔加入180 µl该溶液，再向每孔加入20 µl诱导后的HEK-Blue IFN-α/β细胞上清液，将板置于37 °C培养箱中孵育，直至标准IFN对照孔中出现颜色变化。
6. 使用分光光度计在620–655 nm波长下测定SEAP水平，并根据IFN标准曲线的线性部分外推确定I型IFN的浓度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MT4 细胞	NIH 艾滋病试剂计划	120	本试剂由美国国家卫生研究院（NIH）艾滋病试剂计划、国家过敏与传染病研究所（NIAID）艾滋病部提供：来自 Douglas Richman 博士的 MT-4 细胞。
HEK-Blu IFN-α/β 报告细胞	Invivogen	HKB-IFNAB
RPMI	Wisent	350-000-CL
DMEM	Wisent	319-005-CL
FBS	Wisent	080-150
PHA-L	Sigma-Aldrich	O2769
CD4+ T 细胞分离试剂盒 II	Myltenyi	130-091-155
Diamond 浆细胞样树突状细胞分离试剂盒 II	Myltenyi	130-097-240
QUANTI-Blue	Cedarlane	REP-QB2
2.5 mg/ml 人 IgG	Sigma-Aldrich	I 4506