使用分泌型胚胎碱性磷酸酶报告基因测定法定量生物活性 I 型干扰素

Abstract

来源:Bego， M. G. et al.， 使用离体共培养系统评估浆细胞样树突状细胞对 HIV-1 感染的 CD4⁺ T 细胞的先天感知。J. Vis. Exp. （2015 年）

该视频演示了使用 HEK-Blue 干扰素-α/β 报告细胞分泌的胚胎碱性磷酸酶测定，以量化 HIV-1 感染的 CD4⁺ T 细胞刺激浆细胞样树突状细胞后释放的 I 型干扰素 （IFN）。

Protocol

1. 使用 HEK-Blue IFN-α/β 报告细胞测量生物活性 I 型 IFN。

注:这些细胞是通过用人 STAT2 和 IRF9 基因稳定转染 HEK293 细胞产生的，以获得完全活跃的 I 型 IFN 信号通路。它们还包含分泌型碱性磷酸酶 （SEAP） 报告基因，受 IFN-α/β 诱导型 ISG54 启动子控制。用 I 型 IFN 刺激这些细胞会激活 JAK/STAT/ISGF3 通路并诱导 SEAP 的产生。

1. 将 HEK-Blue IFN-α/β 细胞维持在补充有 10% FBS 的 DMEM 中。将它们以每孔 50,000 个细胞的密度接种在平底 96 孔板中，最终体积为 180 μl。
2. 将 220 μl PBMC（以 850,000 个细胞/ml 稀释）或 220 μl 浆细胞样树突状细胞 （pDC）（浓度范围为 100,000 至 500,000 个细胞/ml）与 30 μl 感染的 T 细胞（以 10⁶ 个细胞/ml 稀释）混合在 U 形底 96 孔板中。
3. 将共培养物在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 18-22 小时，然后转移到 V 形底 96 孔板中。以 400 x g 离心 5 分钟。
4. 向每个孔中加入 20 μl 共培养上清液，一式两份。每个板还需要一组内标对照品（人 IFNα，终浓度为 100 U/ml 至 2,500 U/ml）。将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 18-22 小时。
5. 使用 QUANTI-Blue 溶液测定碱性磷酸酶活性水平，在酶存在下，该溶液从粉红色变为紫色/蓝色。按照制造商的建议准备 QUANTI-Blue。将 180 μl 该溶液加入平底 96 孔板的每个孔中。向每个孔中加入 20 μl 诱导的 HEK-Blue IFN-α/β 细胞上清液，并将板在 37 °C 培养箱中孵育，直到在标准 IFN 对照孔中显色。
6. 使用分光光度计在 620-655 nm 处评估 SEAP 水平，并通过从 IFN 标准曲线的线性部分外推来确定 I 型 IFN 的浓度。

Materials