一种通过哺乳动物系统产生流感病毒样颗粒的技术

摘要

来源：Arevalo, M. T. 等  用于疫苗接种的病毒样颗粒的表达与纯化 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了在哺乳动物系统中生成流感病毒样颗粒（VLPs）的方法。通过在合适的哺乳动物宿主细胞中表达三种编码不同病毒结构蛋白的真核表达载体，表达的病毒蛋白可在宿主细胞质膜上自我组装形成VLPs，并通过细胞表面出芽的方式释放。

方案

1. 用于产生流感H3N2病毒样颗粒的哺乳动物表达系统

1. 将病毒结构糖蛋白血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）以及人免疫缺陷病毒（HIV）Gag（特异性群抗原）p55亚克隆至真核表达载体中，例如先前描述的pTR600。
2. 在化学感受态细胞中扩增 DNA 大肠杆菌 (例如，DH5α）中提取转染级质粒，具体操作按照质粒纯化试剂盒的说明书进行。DNA用量取决于提取产量及使用者的具体需求。
3. 在含10%胎牛血清（FBS）的培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养293T哺乳动物细胞系₂ 在湿润的培养箱中。
4. 培养细胞，使一个T-150组织培养瓶中含有45–75 × 10⁶个细胞⁶ 每瓶细胞接种数量应确保细胞在次日完全贴壁并达到85%–95%的融合度。在显微镜下观察细胞，确认达到预期融合度。
   注意： 高细胞密度通常有助于在使用商用转染试剂时实现最佳蛋白表达并最大限度降低细胞毒性，然而细胞过度汇合可能导致细胞代谢废物积累，从而降低细胞活力。
5. 转染当天，按照生产商的建议配制脂质体与DNA混合物，并使用HA:NA:Gag 每T-150培养瓶加入总DNA量为40 µg。将DNA和脂质体溶液用无血清转染培养基（不含抗生素）稀释，使每瓶总体积为20–30 ml。
   注意： 基因质粒的比例可能需要用户进行优化。尽管本文未予展示，但类似转染程序已使用呼吸道合胞病毒（RSV）F蛋白与HIV Gag蛋白以1:1比例进行。对于登革病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）的单表达质粒，每T-150培养瓶使用总计20 µg DNA可实现最佳表达。DNA与转染试剂的比例由用户优化确定。请根据所采用的转染方法选用推荐的转染培养基。 即，多阳离子脂质转染建议减少或不使用胎牛血清，因此可在无血清培养基中添加生长激素和微量元素以支持细胞生长。
6. 将培养瓶放回 37 °C、5% CO 环境中₂ 培养箱。对于200 ml的体积，使用9个T-150培养瓶。细胞在转染培养基中培养，直至病毒样颗粒（VLP）收获当天。
7. 转染后根据抗原不同在72-96小时收获细胞培养上清，或当显微镜观察估计细胞活力降至70-80%时进行收获。将上清转移至50 ml锥形管中，以500 × g 在 4 °C 下离心 5 分钟以沉淀细胞碎片。
   注意：将贴壁细胞中培养3天的上清液更换为新鲜的预热无血清转染培养基，可获得第二批病毒样颗粒（VLPs），其产量与第一批相似或略有降低，具体效果需由使用者进行优化。
8. 合并上清液，经0.22 µm孔径滤膜过滤后离心沉淀 通过 超速离心

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
质粒大提试剂盒	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Cimarec I 6点磁力搅拌板	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear 超速离心管	Seton	7025
0.22 μm 真空滤器上部（500 mL）	Nalgene	569-0020
甘油	Sigma	G5516