一种通过哺乳动物系统生成流感病毒样颗粒的技术

1. 用于产生流感 H3N2 VLP 的哺乳动物表达系统

将
1. 病毒结构糖蛋白血凝素 （HA）、神经氨酸酶 （NA） 和人类免疫缺陷病毒 （HIV） Gag（组特异性抗原）p55 亚克隆到真核表达载体中，例如前面描述的 pTR600。
2. 在化学感受态大肠杆菌（例如 DH5α）中扩增 DNA，并按照制造商的说明使用质粒纯化试剂盒分离转染级质粒。DNA 的量取决于产量和用户的需求。
在
3. 加湿培养箱中，将哺乳动物细胞系 293T 维持在含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 5% CO₂ 的生长培养基中。
4. 培养细胞，使 T-150 组织培养瓶每个培养瓶包含 45-75 x 10⁶ 个细胞，以便培养瓶在第二天获得完全的细胞粘附和 85-95% 的细胞汇合度。在显微镜下检查细胞是否达到所需的汇合度。
   注意:使用市售转染试剂时，通常建议高细胞密度以产生最佳蛋白表达和最小的细胞毒性，但过度汇合可能会导致细胞废物副产物积累并降低细胞活力。
5. 在转染当天，根据制造商的建议制备脂质体和 DNA 混合物，并用 DNA 组成为 1:1:2 的 HA:NA:Gag 转染 DNA 细胞，每个 T-150 培养瓶的总 DNA 量为 40 μg。在不含抗生素的无血清转染培养基中稀释 DNA 和脂质体溶液，使每个培养瓶的总体积为 20-30 ml.
   注意:基因构建体的比例可能需要用户优化。虽然此处未演示，但已以 1:1 的比例对呼吸道合胞病毒 （RSV） F 和 HIV Gag 进行了类似的转染程序。对于 DENV 和 CHIKV 单表达质粒，每个 T-150 培养瓶总共使用 20 μg DNA 以实现最佳表达。DNA:转染试剂比例经过用户优化。使用基于转染方法的推荐转染培养基，即多阳离子脂质体转染建议减少或不存在胎牛血清，因此培养基可以补充生长激素和微量元素，以支持在没有血清的情况下生长。
6. 将培养瓶放回 37 °C，用 5% CO₂ 培养箱。对于 200 ml 的体积，使用 9 个 T-150 培养瓶。将细胞保存在转染培养基中直至 VLP 收获之日。
7. 转染后 72-96 小时后，根据抗原的不同，或者当细胞活力下降到 70-80% 时，根据显微镜检查估计，从细胞中收获培养上清液。将上清液转移到50 ml锥形管中，并在4°C下以500 × g旋转细胞5分钟以沉淀细胞碎片><。 注意:用新鲜的预热、无血清转染培养基代替贴壁细胞的 3 天上清液将产生第二批产量相似或略有降低的 VLP，应由用户进行优化。
8. 混合上清液并通过 0.22 μm 孔膜过滤，然后通过超速离心沉淀。