一种通过哺乳动物系统产生流感病毒样颗粒的技术

摘要

来源：Arevalo, M. T. 等  用于疫苗接种的病毒样颗粒的表达与纯化 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了在哺乳动物系统中生成流感病毒样颗粒（VLPs）的方法。通过在合适的哺乳动物宿主细胞中表达三种编码不同病毒结构蛋白的真核表达载体，表达的病毒蛋白可在宿主细胞质膜上自我组装形成VLPs，并通过细胞表面出芽的方式释放。

方案

1. 用于产生流感H3N2病毒样颗粒的哺乳动物表达系统

1. 将病毒结构糖蛋白血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）以及人免疫缺陷病毒（HIV）Gag（特异性群抗原）p55亚克隆至真核表达载体中，例如先前描述的pTR600。
2. 在化学感受态细胞中扩增 DNA 大肠杆菌 (例如，DH5α）中提取转染级质粒，具体操作按照质粒纯化试剂盒的说明书进行。DNA用量取决于提取产量及使用者的具体需求。
3. 在含10%胎牛血清（FBS）的培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养293T哺乳动物细胞系₂ 在湿润的培养箱中。
4. 培养细胞，使一个T-150组织培养瓶中含有45–75 × 10⁶个细胞⁶ 每瓶细胞接种数量应确保细胞在次日完全贴壁并达到85%–95%的融合度。在显微镜下观察细胞，确认达到预期融合度。
   注意： 高细胞密度通常有助于在使用商用转染试剂时实现最佳蛋白表达并最大限度降低细胞毒性，然而细胞过度汇合可能导致细胞代谢废物积累，从而降低细胞活力。
5. 转染当天，按照生产商的建议配制脂质体与DNA混合物，并使用HA:NA:Gag 每T-150培养瓶加入总DNA量为40 µg。将DNA和脂质体溶液用无血清转染培养基（不含抗生素）稀释，使每瓶总体积为20–30 ml。
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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
质粒大提试剂盒	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Cimarec I 6点磁力搅拌板	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear 超速离心管	Seton	7025
0.22 μm 真空滤器上部（500 mL）	Nalgene	569-0020
甘油	Sigma	G5516