利用昆虫细胞中杆状病毒表达系统产生基孔肯雅病毒样颗粒

摘要

来源：Arevalo, M. T. 等，用于疫苗接种的病毒样颗粒的表达与纯化 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了如何通过用携带基孔肯雅病毒基因盒的重组杆状病毒感染昆虫细胞，从而产生病毒样颗粒（VLPs）。重组病毒感染细胞后，可诱导VLP的形成、组装并释放到培养基中，有望用于疫苗生产。

方案

1. 利用杆状病毒/昆虫细胞系统表达基孔肯雅病毒样颗粒（VLP）

1. 利用商业化的杆状病毒表达系统，从S-27毒株中生成表达基孔肯雅病毒衣壳蛋白和包膜蛋白（C-E3-E2-6K-E1）的重组杆状病毒。
2. 培养 草地贪夜蛾 Sf9细胞在含100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素的无血清Sf9培养基中，28 °C培养。使用3-5 x 10⁵ c/ml 以启动旋转瓶培养，用于悬浮细胞生长。当细胞密度达到 2-4 x 10⁶ c/ml（每3-4天）
3. 在多点磁力搅拌系统上，将Sf9细胞悬浮培养于旋转烧瓶中，搅拌速度为130 rpm。为保证充分通气，培养液体积不得超过旋转烧瓶容量的一半。
4. 为表达基孔肯雅病毒（Chikungunya）或CHIK VLPs，以2 x 10⁶细胞/mL的密度感染Sf9细胞⁶ 以感染复数为1的重组杆状病毒感染细胞，终浓度为细胞数/ml，然后放回28 °C培养箱。通常感染一个或两个含250 ml Sf9细胞的旋转培养瓶。
   注意： 虽然我们不采用此方法，但Sf9细胞可在28 °C下使用摇床平台于摇瓶中培养。
5. 在感染后72-96小时收获培养物，或根据台盼蓝染色排除法按照试剂盒说明书测定细胞活力降至70-80%时进行收获。
   注意： 细胞在感染后仍持续增殖，在感染重组CHIK VLP杆状病毒3天后，Sf9细胞培养物的存活率约为80%。杆状病毒感染的细胞体积增大，形态可能由圆形变为椭圆形。在杆状病毒感染的晚期阶段，细胞开始发生裂解。
6. 将悬浮培养物直接转移至50 ml锥形管中，于500 x g离心沉淀细胞 g 4 °C下离心5分钟。
7. 收集上清液，经 0.22 µm 滤膜过滤后离心沉淀 通过 超速离心

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统	Life Technologies	10359-016
0.22 μm 真空滤器上部（500 mL）	Nalgene	569-0020
Sf-900 II 无血清培养基	赛默飞世尔科技	10902-096
Cimarec I 6 多点搅拌器板	ThermoFisher Scientific	50094596