在昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统生成基孔肯雅热病毒样颗粒

摘要

来源:Arevalo， M. T. et al.， 用于疫苗接种的病毒样颗粒的表达和纯化。J. Vis. Exp. （2016 年）

该视频展示了如何通过用携带基孔肯雅热病毒基因盒的重组杆状病毒感染昆虫细胞来产生病毒样颗粒 VLP。重组病毒感染细胞，导致 VLP 形成、组装并释放到培养基中，可能用于疫苗生产。

方案

1. 使用杆状病毒/昆虫细胞系统表达基孔肯雅病毒样颗粒 （VLP）

1. 使用市售杆状病毒表达系统从 S-27 菌株中生成表达基孔肯雅病毒衣壳和包膜蛋白 （C-E3-E2-6K-E1） 的重组杆状病毒。
2. 在含有 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的无血清 Sf9 生长培养基中，在 28 °C 下培养草地贪夜蛾 Sf9 细胞。使用 3-5 x 10⁵ c/ml 引发旋转瓶培养物，用于悬浮细胞生长。当它们达到 2-4 x 10⁶ c/ml 的细胞密度时（每 3-4 天一次），常规传代。
在
3. 旋转瓶中以 130 rpm 的转速在多点搅拌板系统上以 130 rpm 的转速搅拌悬浮培养 Sf9 细胞。为了适当通气，将培养体积保持在不超过旋转瓶体积的一半。
4. 对于基孔肯雅热或 CHIK VLP 的表达，用感染复数为 1 的重组杆状病毒以 2 x 10⁶ 个细胞/ml 的密度感染 Sf9 细胞，并返回到 28 °C 培养箱中。通常，感染一个或两个含有 250 ml Sf9 细胞的旋转瓶><。 注意:虽然我们不使用这种方法，但可以使用摇床平台在 28 °C 的摇瓶中培养 Sf9 细胞。
感染
5. 后 72-96 小时后，或根据制造商方案由台盼蓝排除法确定的细胞活力降至 70-80% 时收获培养物><。 注意:细胞在感染时继续增殖，感染后 3 天 （dpi） 用重组 CHIK VLP 杆状病毒感染的 Sf9 培养物的活力为 ~80%。杆状病毒感染的细胞外观较大。形态也可能从圆形变为长方形。在杆状病毒感染的晚期，细胞开始裂解。
6. 将培养物直接从悬浮培养物转移到 50 ml 锥形管中，并在 4 °C 下以 500 x g 的速度旋转细胞 5 分钟。
7. 收集上清液并通过 0.22 μm 孔膜过滤，然后通过超速离心沉淀。

材料