利用活体显微镜分析炎症小鼠模型中血细胞与内皮细胞的相互作用

摘要

来源：Herr, N. 等，小鼠肠系膜静脉中白细胞-内皮细胞及血小板-白细胞相互作用的活体显微观察。J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们展示了经腹腔注射脂多糖的小鼠模型肠系膜静脉中血细胞与内皮细胞相互作用的实时可视化过程。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物处理、准备及炎症诱导

1. 使用4至6周龄的雄性小鼠，体重范围为16至20 g。注意：若小鼠年龄较大或体重较重，则血管周围脂肪过多，会限制显微镜下的观察。
2. 手术前对所有器械和显微镜操作台进行灭菌处理。
3. 在显微观察前4小时，向活体小鼠腹腔注射20 mg/kg的LPS（脂多糖），以诱导细菌性炎症。
4. 将0.9%生理盐水溶液置于37 °C水浴中预热，用于湿润塑料腔室和肠系膜组织。
5. 在显微观察前立即通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）对小鼠进行麻醉。也可使用其他麻醉方法，例如，吸入2%异氟烷。通过检测反射刺激（用力捏压脚趾或尾巴）无反应来确认麻醉效果。
6. 使用剃毛器去除腹部毛发，并用70%乙醇浸湿的纱布清除松散的毛发。
7. 在麻醉期间，于小鼠眼部涂抹兽用眼膏，以防角膜干燥。

2. 手术

1. 使用70%乙醇对腹部进行消毒。该方法并非无菌操作，实验结束时可能对动物造成致命影响。
2. 行正中剖腹术：使用小型弯头镊子和小剪刀切开腹部皮肤。辨认剑突下血管，并在白线区域切开腹膜，以保护这些血管。
3. 向腹腔内滴加数滴预热的生理盐水，以保持组织湿润。
4. 通过眶后注射50 µl罗丹明6G（1 mg/ml）对白细胞和血小板进行荧光标记。
5. 外置一段回肠袢并置于直径为10 cm的培养皿中；每隔一分钟滴加一次37 °C预热的生理盐水（0.9%），确保组织保持湿润。

3. 活体显微成像

1. 将小鼠置于显微镜下，使直径为 200 - 300 µm 的肠系膜静脉位于视野中央。选择周围无明显脂肪组织的血管。
2. 避免触碰肠系膜血管，以防止刺激内皮细胞。小心操作回肠袢。
3. 使用倒置或正置显微镜配合相机及显微镜软件，观察血细胞与内皮细胞的相互作用。每只小鼠在 4 条不同的静脉中各记录 1 分钟的血细胞-内皮细胞相互作用。
4. 成像实验完成后，通过颈椎脱臼法处死小鼠。

4. 分析

1. 对所有参数进行离线且盲法分析。使用任何合适的软件程序进行分析。
2. 在高时间分辨率的动态影像片段（最高帧率）中，聚焦管腔内血细胞流动，确认血流状态稳定且个体间具有可比性。
3. 定量滚动白细胞的数量。为此，在静脉中画一条垂直线，统计1分钟内通过该线的所有白细胞数量。
4. 通过测量单个白细胞在内皮上稳定滚动时通过50 µm距离所需的时间，确定其滚动速度。操作时，在静脉中画两条相距50 µm的垂直线。
   1. 测量一个代表性白细胞从一条线移动到另一条线所需的时间。通过将50 µm除以所需时间，计算白细胞的滚动速度（µm/s）。
5. 在0.04 mm²的视野范围内测量白细胞黏附数量。为此，在静脉内绘制一个边长为200 µm的正方形。
   1. 统计该正方形内牢固黏附的白细胞数量，定义为在30秒内无可见移动的白细胞。
6. 计数结合在单个白细胞上的血小板数量，以定量血小板-白细胞相互作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
罗丹明6G	Sigma-Aldrich	989-38-8
来自大肠杆菌（Escherichia coli）055:B5的脂多糖	Sigma-Aldrich	L2637