皮下注射细菌抗原以在小鼠模型中诱导全身性炎症

摘要

来源：John, S. 等，启动型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）作为感染后葡萄膜炎的模型 J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了在麻醉小鼠中诱导全身性炎症的过程。注射分枝杆菌抗原-佐剂储库可触发细胞因子释放并引发局部炎症。淋巴管开放，使免疫细胞进入淋巴结并激活T细胞，T细胞释放促炎性细胞因子，导致广泛的炎症反应。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 皮下注射抗原的制备

1. 在进行本节所有操作时，均须在化学通风橱内操作，以避免吸入或皮肤接触结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37Ra 菌粉。根据本机构对完全弗氏佐剂（通常为 BSL-1 级别）的管理规定进行操作，包括佩戴耐化学腐蚀手套、安全护目镜和防护工作服（实验服）。
2. 采用良好的无菌技术，防止引入实验动物的试剂受到污染。
3. 在 5 mL 微量离心管中，将 5 mg 冻干灭活的 Mycobacterium tuberculosis H37Ra 菌粉与 2.5 mL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS）混合，配制 Mtb 悬液。涡旋振荡 30 秒后置于冰上。
4. 为在 PBS 中形成 H37Ra 的细小悬液，将悬液置于冰上超声处理 5 分钟。
   1. 松开转换器单元主体，用 70%（v/v）酒精棉片清洁探头。
   2. 开启超声仪，旋转功率调节旋钮将功率设为 4，将探头尖端浸入含有分枝杆菌菌粉的 PBS 中。确保探头尖端至少浸入样品深度的一半，且探头尖端不接触微量离心管管壁。
5. 在冰上超声处理 30 秒，暂停 30 秒，重复操作直至累计超声时间达 5 分钟，以充分分散菌粉形成均匀悬液，同时避免液体过热。
6. 向混合物中加入 2.5 mL 弗氏不完全佐剂，并在冰上重复超声处理，直至乳剂形成类似牙膏状的稠度。
7. 使用控制旋钮将功率调至 0，关闭仪器以结束超声。将探头从乳剂中取出，并用酒精棉片擦拭探头表面。
8. 将抗原乳剂储存于 4 °C。制备批量乳剂有助于确保不同实验间的一致性。乳剂可在 4 °C 下保存最长 3 个月。

2. 皮下注射

1. 在玻璃体内注射前一周进行皮下注射（指定为第 -7 天）。
2. 用 1 mL 注射器（不连接针头）吸取分枝杆菌乳剂。由于乳剂具有黏稠性和不透明性，注射器内容易混入难以察觉的气泡。
   1. 为防止注射器内产生气泡，在吸入 0.2–0.3 mL 乳剂后，将注射器倒置（针头朝上），并轻轻反复敲击台面边缘，使气泡上升至表面。
3. 排出注射器内的空气后继续加注乳剂。在填充过程中反复倒置并轻敲注射器，直至完全充满。
4. 将 25 G 针头安装到注射器上，并推动乳剂使其充满针头。使用前将注射器置于冰上保存。
5. 为安全实施皮下注射，可选择麻醉小鼠，或采用人道固定方法，以便于接触动物的后肢区域。
6. 若需麻醉以进行皮下注射，将动物置于异氟烷诱导舱中（诱导浓度为 3%–4%，维持浓度为 1%–3%）。麻醉成功后，应确保小鼠呼吸频率缓慢，且无呼吸困难迹象。
7. 将皮下注射部位选择在髋部背侧或腹股沟淋巴结区域附近的腿部腹侧。
   1. 小心插入针头，避免将药物注入肌肉内。向皮下间隙注射 0.05 mL 结核分枝杆菌（Mtb）乳剂。不要立即拔出针头，以便充分完成黏稠乳剂的注射。
   2. 在左右两侧分别重复注射，每只动物总注射量为 0.1 mL。
8. 若已麻醉，将小鼠置于温热的加热垫上直至完全恢复。在小鼠恢复至能够自主维持胸卧位之前，不得无人看管。
9. 小鼠完全恢复后将其放回笼中，并在笼卡上标注皮下注射的日期。
10. 给予口服对乙酰氨基酚镇痛（200 mg/kg/天），但避免使用非甾体抗炎药（NSAIDs），因为抗炎药物可能影响葡萄膜炎的诱导。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
弗氏不完全佐剂	BD Difco，新泽西州，美国	263910
H37Ra 冻干粉 分枝杆菌 提取	BD Difco，新泽西州，美国	231141
胰岛素注射针头	Exel International，美国	26029	1 mL
异氟烷
PBS	Gibco	14190
RM2255	Leica Biosystems，伊利诺伊州，美国		组织切片
结核病注射器	Becton, Dickinson and Company，新泽西州，美国	309602	1 mL
泰诺	Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, 美国	NDC 50580-614-01	对乙酰氨基酚