一种用于研究感染后葡萄膜炎的经致敏的分枝杆菌性葡萄膜炎小鼠模型

摘要

来源：John, S.，et al。 启动型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）作为感染后葡萄膜炎的模型。 J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种用于研究感染后葡萄膜炎的致敏型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）小鼠模型的建立方法。通过在先前用相同免疫原致敏的小鼠中进行玻璃体内注射热灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）以诱导PMU，随后利用影像学和组织病理学检查分析眼部慢性炎症的发展过程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 皮下注射抗原的制备

1. 本节所有操作均须在化学通风橱内进行，以避免吸入或皮肤接触 结核分枝杆菌 （结核分枝杆菌）H37Ra 干粉。请根据您所在机构对完全弗氏佐剂的管理规定（通常为生物安全等级1级）进行操作。操作时应佩戴耐化学腐蚀手套、安全护目镜及防护工作服（实验服）。
2. 采用良好的无菌技术，以防止引入实验动物的试剂受到污染。
3. 在5 mL微量离心管中，将5 mg冻干的热灭活Mtb H37Ra粉末与2.5 mL冷的磷酸盐缓冲液（PBS）混合，制备Mtb悬液。涡旋振荡30秒一次，然后置于冰上。
4. 为在PBS中形成H37Ra的细小悬浮液，将悬浮液在冰上超声处理5分钟。
   1. 松开转换器单元的主体，用70%（v/v）酒精棉签清洁探头。
   2. 打开超声波破碎仪，通过旋转功率控制旋钮将功率设置为4，然后将探针尖端浸入含有PBS的分枝杆菌粉末中。确保探针尖端浸入深度至少达到样品深度的一半，且探针尖端不接触微量离心管管壁。
5. 将混合物在冰上超声处理30秒，暂停30秒，重复操作，总时长5分钟，以充分分散粉末，形成均匀悬浮液，同时避免液体过热。
6. 加入2.5 mL弗氏不完全佐剂至混合物中，并在冰上重复超声处理，直至乳剂形成类似牙膏的稠度。
7. 使用控制旋钮将功率调至0，关闭设备以结束超声处理。将探头从悬浮液中取出，并用酒精棉片擦拭探头。
8. 将抗原乳剂储存于 4 °C。制备乳剂批次有助于确保实验间的重复性。该乳剂可在 4 °C 下储存长达 3 个月。

2. 皮下注射

1. 在玻璃体内（IVT）注射前一周进行皮下注射（定为第 -7 天）。
2. 用 1 mL 注射器（不带针头）吸取分枝杆菌乳剂。由于乳剂具有黏稠性和不透明性，注射器中可能产生难以察觉的气泡。
   1. 为防止注射器中出现气泡，在吸入 0.2–0.3 mL 乳剂后，将注射器倒置（针头朝上），并轻轻反复敲击操作台边缘，使气泡上升至表面。
3. 排出注射器中的空气，并继续填充乳剂。在填充过程中反复倒置并轻敲注射器，直至完全充满。
4. 在注射器上安装 25 G 针头，并推动乳剂充满针头。使用前将注射器置于冰上保存。
5. 为安全实施皮下注射，可对小鼠进行麻醉，或采用人道的固定方法，以便于接触动物的后肢区域。
6. 若需麻醉以进行皮下注射，将动物置于异氟烷诱导舱中（诱导浓度为 3%–4%，维持浓度为 1%–3%）。麻醉后，确保小鼠呼吸频率缓慢，且无呼吸困难迹象。
7. 将皮下注射部位选择在髋部背侧或腹股沟淋巴结区域附近的腿部腹侧。
   1. 小心插入针头，避免将乳剂注入肌肉内。向皮下间隙注射 0.05 mL 结核分枝杆菌（Mtb）乳剂。不要立即拔出针头，以确保黏稠的乳剂完全注入。
   2. 在左右两侧分别重复注射，每只动物总注射量为 0.1 mL。
8. 若已麻醉，将小鼠置于温热的加热垫上直至完全恢复。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。
9. 小鼠完全恢复后将其放回笼中，并在笼卡上标注皮下注射的日期。
10. 给予口服对乙酰氨基酚镇痛（200 mg/kg/天），但避免使用非甾体抗炎药（NSAIDs），因为抗炎药物可能影响葡萄膜炎的诱导。

3. 玻璃体内注射用抗原储备液的制备

1. 本节所有操作均需在适当的无菌条件下进行，以防止眼内注射用结核分枝杆菌悬液被污染。
2. 制备眼内注射用悬液。
   1. 为诱导轻度至中度全葡萄膜炎，将5 mg分枝杆菌提取物加入1 mL 1×PBS中，配制成浓度为5 mg/mL的眼内注射用悬液。
   2. 为诱导中度至重度全葡萄膜炎，将10 mg分枝杆菌提取物加入1 mL 1×PBS中，配制成浓度为10 mg/mL的眼内注射用悬液。
3. 涡旋振荡30秒一次，然后置于冰上。
4. 为在PBS中形成H37Ra的细小悬液，按照步骤1.4所述方法，在冰上超声处理10分钟。将该原液分装为每份100 µL，于-20 °C保存。
5. 使用前于室温下解冻，并在高速下涡旋振荡1分钟。运输至动物实验设施过程中，始终保持分装样品处于冰上。

第0天玻璃体内注射操作步骤

1. 动物准备
   1. 佩戴合身的检查手套，将小鼠置于电子天平上，称量其体重（单位：克）。
   2. 按每克体重0.02 mL的剂量，向小鼠腹腔注射含有100 mg/mL氯胺酮和20 mg/mL赛拉嗪并用无菌水稀释的混合溶液，以麻醉动物。替代方法包括使用约1.5%异氟烷进行吸入诱导麻醉。
   3. 等待约2分钟，待小鼠进入睡眠状态后，将其放入保温箱中，并盖上盖子。通过耳部、脚趾和尾部夹捏等疼痛反射测试，评估麻醉深度。
   4. 小鼠入睡后，在角膜上滴加1滴0.5%（v/v）丁卡因进行局部麻醉。注意避免丁卡因接触小鼠鼻部或口部。10秒后，用棉签吸除多余液体。
      注意：观察发现，使用表面麻醉剂可改善虹膜扩张和前房（AC）的可视化效果，这可能是由于全身麻醉联合局部麻醉更好地抑制了角膜反射。但如需要，此步骤可省略。
   5. 滴加1滴2.5%（v/v）去氧肾上腺素以扩张瞳孔。操作时需小心，避免多余液滴进入鼻腔或口腔。2-3分钟后，吸除多余液体。
   6. 为降低眼内炎风险，向眼部表面及周围毛发滴加1滴5%聚维酮碘，作用2-3分钟。
      注意：本节所有操作均应在适当的无菌条件下进行，以预防眼内炎。
   7. 清除聚维酮碘后，使用羟丙基甲基纤维素（0.3%）或卡波姆眼用凝胶（0.2% w/w）覆盖眼球，防止麻醉期间角膜干燥。此措施亦有助于预防白内障形成。
2. 微注射系统的设置
   1. 使用连接至微注射泵控制器和注射器的微量泵进行玻璃体内注射（图1A-C）。或者，也可使用连接至Hamilton注射器的33 G针头，具体操作见第4.4小节。
   2. 将34 G针头连接至注射支架上以组装注射装置。松开注射支架前端的银色螺帽，将针头插入支架体内约一半深度，然后用手拧紧银色螺帽。
   3. 按照步骤4.2.4-4.2.5所述，将管路连接至注射支架。
   4. 为将管路插入注射支架，松开支架后端的塑料螺钉，将管路穿过内部垫圈，再拧紧螺钉。
   5. 保持管路末端与针尖之间留有微小间隙，以防止注射过程中管路受损。参见图1C。
   6. 解冻100 µL分装的分枝杆菌储备悬浮液。
   7. 加入3 µL的1%荧光素钠（AK-Fluor）溶液，并充分涡旋混匀。
   8. 用不含气泡的10 µL注射器吸取抗原与荧光素混合液。
   9. 取下装液针头，将管路穿过银色螺帽内的垫圈，直至管路尖端到达注射器筒体上的零刻度线位置。
   10. 当管路尖端准确对准所需位置后，用手拧紧螺帽。
   11. 推动注射器内液体，使溶液流经注射管路，以完全填充系统。随后重复步骤4.2.8-4.2.11，重新装填注射器以备注射。
   12. 将装填好的注射器安装至微量泵上时，按下微量泵末端的夹钳释放按钮，打开注射器夹钳。
   13. 将推杆帽插入微量泵后端的推杆帽固定槽中。
   14. 然后将注射器卡环滑入卡环止位处，同时将注射器主体插入注射器夹钳中。
   15. 松开夹钳按钮，并拧紧推杆固定螺钉。参见图1D。
   16. 将注射支架及针头穿过立体定位注射装置上的O型夹。该平台为定制装置；也可手动持握并定位注射器。
   17. 在微注射泵控制器上设定输注体积和速率，分别设置为每循环注射500 nL，速率为40 nL/s。
       注意：可使用更快的注射速率，但在重新定位针头前可能出现更多反流。
   18. 在进行玻璃体内注射前，测试系统以确保其正常工作。
       注意：当注射系统正常运行时，踩下脚踏开关或按下控制面板将触发一次注射循环，可见推杆帽固定槽发生明显移动，且针尖处出现少量绿色液体滴出。若无液体流出，可启动额外循环，或冲洗并重新装填注射器。
   19. 注射眼部前，用95%乙醇棉片轻轻擦拭针头。
3. 玻璃体内注射操作
   1. 将小鼠置于立体定位仪上，以执行注射操作。
   2. 通过在平台表面覆盖2-3层纸巾，保持小鼠所处台面温暖。
   3. 将小鼠俯卧于平台上，使用左右耳杆轻柔固定其头部。参见图1E。
   4. 调整小鼠位置，使其处于显微镜视野下，确保右眼鼻上方区域清晰可见。
   5. 使用30 G针头拨开睫毛，暴露巩膜。观察角膜缘及放射状血管。
   6. 使用无菌30 G针头在角膜缘后方1-2 mm处的巩膜上穿刺制备引导孔。
   7. 将连接于注射支架的34 G针头经引导孔以一定角度插入眼内，避免接触晶状体，同时确保针尖进入玻璃体腔。
   8. 通过微注射泵控制器，小心地将1 µL结核分枝杆菌（Mtb）提取物注入玻璃体腔。若持续出现反流，可将注射体积增至1.5 µL，以确保足量递送。
      注意：对于假手术对照组，向动物眼部注射1 µL PBS。
   9. 通过观察眼部是否出现绿色反光，确认注射物位于玻璃体内。参见图1F。
   10. 10秒后，将针头从眼部缓慢拔出。记录是否有反流现象。
   11. 将小鼠从平台上取下，双眼涂抹0.3%羟丙基甲基纤维素或0.2% w/w卡波姆眼膏以保护角膜，并转移至恢复用保温箱。
   12. 在小鼠恢复至能够自主维持胸卧位意识水平前，不得离开看护。在完全恢复前，不得与其他动物合笼。
   13. 当小鼠完全清醒后，将其放回笼中，并提供含对乙酰氨基酚（200-300 mg/kg/天）的饮用水。在笼卡上标注玻璃体内注射的日期。
   14. 玻璃体内注射通常耐受性良好。可能提示疼痛并需终止实验的临床体征包括眶周脱发（提示自残行为）、角膜溃疡、体重下降和弓背姿势。

结果

图1：小鼠玻璃体内注射装置示意图。 小鼠眼内玻璃体注射操作使用（A）连接至（B）微型泵和（C）注射器的显微注射泵控制器进行。注射器装载后安装于（D）微型泵上。通过（E）耳杆固定小鼠头部，以确保玻璃体内注射过程中位置稳定且操作一致。注射液中的（F）荧光素在成功注射后可在眼内产生绿色反光。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AK-FLUOR	美国伊利诺伊州阿科恩制药公司		5 mL 小瓶中含10%荧光素钠（100 mg/mL）
AnaSed	美国伊利诺伊州阿科尔恩动物健康公司	NDC 59399-110-20	Xylazine 20 mg/mL
5% 碘伏无菌眼科清洁液	美国德克萨斯州阿尔康	8007-1
B-D 精密滑动针头 -25 G	Becton, Dickinson and Company，新泽西州，美国	305122
B-D Precision Glide 针头 -30-G	Becton, Dickinson and Company，新泽西州，美国	305106
Bond MAX，Bond Rx	Leica Biosystems，伊利诺伊州，美国		全自动免疫组化染色系统
氯霉素软膏	英国罗姆福德，马廷代尔制药公司		1% w/w 氯霉素
EG1150H	Leica Biosystems，伊利诺伊州，美国		组织包埋
Envisu R2300	Bioptigen/Leica		OCT 机器
弗氏不完全佐剂	BD Difco，新泽西州，美国	263910
GenTeal 润滑眼膏	美国德克萨斯州阿尔康	---
GenTeal 润滑眼用凝胶	美国德克萨斯州阿尔康	---
H37Ra 冻干粉 分枝杆菌 提取	BD Difco，新泽西州，美国	231141
Hamilton RN 针头 (33/12/2)S	内华达州里诺市汉密尔顿	7803-05(33/12/2)	33 G
汉密尔顿注射器	内华达州里诺市，汉密尔顿	CAL7633-01	5 µL
胰岛素注射针头	Exel International，美国	26029	1 mL
异氟烷
Ketaset	硕腾，美国	377341	氯胺酮盐酸盐 100 mg/mL
显微注射器泵和Micro4Controller	美国佛罗里达州世界精密仪器公司	UMP3
Micron IV	Phoenix Research Laboratories，普莱森顿，加利福尼亚州		替代成像/OCT 设备
Nanofil 10 µL 注射器	美国佛罗里达州世界精密仪器公司	NANOFIL
Nanofil 眼内注射套件	美国佛罗里达州世界精密仪器公司	IO-KIT
Olympus SZX10	Olympus		解剖显微镜
PBS	Gibco	14190
盐酸去氧肾上腺素滴眼液 美国药典 2.5% 无菌 15 mL	美国伊利诺伊州阿科恩制药公司	17478020115
RM2255	Leica Biosystems，伊利诺伊州，美国		组织切片
结核病注射器	Becton, Dickinson and Company，新泽西州，美国	309602	1 mL
0.5%丁卡因	美国德克萨斯州阿尔康	1041544
Tissue Tek VIP 系列	Sakura Finetek USA, Inc., CA		组织学样本处理
1% 托吡卡胺	英国罗姆福德乔文制药公司		最小量
泰诺	Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, 美国	NDC 50580-614-01	对乙酰氨基酚
维适泰	诺华制药，英国坎伯利		0.2% w/w 卡波姆眼用凝胶