结核分枝杆菌 BCG lux 感染接种物的制备与定量

摘要

来源：Asai, M. 等人， 无脊椎动物的使用 Galleria mellonella 作为研究感染的模型 Mycobacterium tuberculosis 复合物 视频实验杂志 (2019)

本视频演示了利用生物发光检测法和菌落形成单位计数法，制备和定量Mycobacterium bovis卡介苗lux接种物的过程。制备好的接种物可用于感染研究。

方案

注意：以下所述的所有操作均须在二级微生物安全柜（MSC）内的生物安全二级（CL2）实验室中进行，并遵循当地的健康与安全指南。

1. 准备 结核分枝杆菌牛型亚种 BCG lux 用于感染

1. 解冻一管含有15%甘油的冷冻保存的M. bovis BCG lux菌种，该菌株为经改造携带了pSMT1穿梭质粒的蒙特利尔疫苗株，pSMT1质粒含有来自Vibrio harveyi的luxAB基因，可编码荧光素酶。
2. 在标记好的250 mL锥形瓶中，将1.2 mL解冻后的BCG lux菌液接种至15 mL Middlebrook 7H9液体培养基中，培养基中含0.2%甘油、10%白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）增补剂以及50 µg/mL潮霉素。
3. 将锥形瓶置于密封的生物安全容器中，在37 °C、220 rpm条件下于振荡培养箱中培养72小时（或直至菌液达到对数生长期中期）。
4. 通过制备菌液在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，0.01 M磷酸盐缓冲液，0.0027 M氯化钾，0.137 M氯化钠）中的1:10稀释液（每个样本设两个重复），使用发光仪管进行检测，以评估BCG lux菌液的生长情况。充分涡旋混匀后，将发光仪管放入发光仪中，以正癸醛（在无水乙醇中稀释至1% v/v）作为底物，测定生物发光强度（相对光单位[RLU]/mL）。
   注意：当BCG lux在Middlebrook 7H9液体培养基中体外培养时，RLU与菌落形成单位（CFU）之间的比值先前已确定为3:1。
5. 在室温下以2,175 x g离心10分钟，使菌体沉淀，弃去上清液，并将上清液倒入具有已知抗分枝杆菌活性的适当消毒剂中。所有培养废弃物应按照当地规定，使用适用于分枝杆菌的消毒剂进行处理。
6. 用含0.05%吐温-80（PBS-T）的磷酸盐缓冲液将菌体沉淀清洗两次，以防止细菌聚集。
7. 最后一次清洗后，倾去上清液，将分枝杆菌菌体沉淀重悬于PBS-T中，并根据RLU测定结果将菌悬液稀释至所需细胞密度。
8. 在24孔板中用PBS-T对菌液进行10倍系列稀释，每个样本取10 µL，分别接种至Middlebrook 7H11琼脂平板（含0.5%甘油、50 µg/mL潮霉素、10%油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶[OADC]）上，每个样本设两个重复，用于测定接种物的CFU数量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 离心管（Eppendorf）	Eppendorf	22431021
20、200 和 1000 µl 移液器及滤芯吸头	任意供应商	n/a
24 孔培养板	Greiner	662160
25 ml 移液管和移液器	任意供应商	n/a
三区培养皿（94/15 mm）	Greiner	637102
离心机	任意供应商	n/a
II 级生物安全柜	任意供应商	n/a
乙醇（>99.7%）	VWR	208221.321
甘油	Sigma-Aldrich	G5150
潮霉素 B	Corning	30-240CR
发光检测仪（Autolumat LB 953）	Berthold	34622
发光检测管	Corning	352054
微量离心机	任意供应商	n/a
Middlebrook 7H11 琼脂	BD Bioscience	283810
Middlebrook 7H9 肉汤	BD Bioscience	271310
Middlebrook ADC 增补剂	BD Bioscience	212352
Middlebrook OADC 增补剂	BD Bioscience	212240
Mycobacterium bovis BCG lux	多种来源	n/a
正癸醛（n-decyl aldehyde）	Sigma-Aldrich	D7384-100G
轨道摇床培养箱	任意供应商	n/a
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
吐温-80（Polysorbate 80）	Sigma-Aldrich	P8074-500ml
带通气盖的锥形瓶（250 ml）	Corning	CLS40183
Winterm（V1.08）	Berthold	n/a	程序 LB953.TTB