建立昆虫幼虫细菌感染模型的技术

摘要

来源：Asai, M., 等 无脊椎动物的使用 Galleria mellonella 作为研究感染的模型 结核分枝杆菌 复合物 视频实验杂志 (2019).

本视频展示了一种在大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫体内建立Mycobacterium bovis感染模型的方法。将一株发光的Mycobacterium bovis BCG菌株注入幼虫血淋巴以建立感染，并在预设的时间间隔测量生物发光信号，以研究感染进程。

方案

注意：以下所述的所有操作均须在二级微生物安全柜（MSC）内的生物安全二级（CL2）实验室中进行，并遵循当地的健康与安全指南。

1. 感染用M. bovis BCG lux 的制备

1. 解冻一管1.2 mL含15%甘油的冷冻保存的M. bovis BCG lux菌种，该菌株为蒙特利尔疫苗株，经含有来自Vibrio harveyi的luxAB基因（编码荧光素酶）的穿梭质粒pSMT1转化而成。
2. 在标记好的250 mL锥形瓶中，将1.2 mL解冻后的BCG lux菌液接种至15 mL Middlebrook 7H9液体培养基中，该培养基含有0.2%甘油、10%白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）增补剂以及50 µg/mL潮霉素。
3. 将锥形瓶置于密封的生物安全容器中，在37 °C、220 rpm条件下于摇床培养箱中培养72小时（或直至菌液达到对数生长期中期）。
4. 通过将菌液用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，0.01 M磷酸盐缓冲液，0.0027 M氯化钾，0.137 M氯化钠）按1:10比例稀释，分别取两份加入发光仪检测管中，涡旋混匀后放入发光仪，以正癸醛（1% v/v溶于无水乙醇）为底物测定生物发光强度（相对光单位[RLU]/mL），从而检测BCG lux菌液的生长情况。
   注意：此前已确定当BCG lux在Middlebrook 7H9液体培养基中体外培养时，RLU与菌落形成单位（CFU）的比值为3:1。
5. 在室温下以2,175 × g离心10分钟，使菌体沉淀，弃去上清液并将其倒入具有已知抗分枝杆菌活性的适当消毒剂中。所有培养废弃物应按照当地规定使用适用于分枝杆菌的消毒剂进行处理。
6. 用含0.05%吐温-80（PBS-T）的PBS缓冲液洗涤菌体沉淀两次，以防止细菌聚集。
7. 最后一次洗涤后，倾去废液上清，将分枝杆菌菌体沉淀重悬于PBS-T中，并根据RLU测定结果调整菌悬液至所需细胞密度。
8. 在24孔板中用PBS-T对菌液进行10倍系列稀释，取10 µL稀释液双份点种于Middlebrook 7H11琼脂平板（含0.5%甘油、50 µg/mL潮霉素、10%油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶[OADC]）上，用于测定接种物的CFU数量。

2. G. mellonella 幼虫的制备

1. 从合适的来源购买末龄幼虫，收到后在18 °C避光条件下饲养，并在购买后1周内使用。或者，可按照Jojāo等人的方案自行培育幼虫。对于购买的幼虫，在储存前应剔除任何死亡、变色或化蛹的个体。
   注意：化蛹幼虫在形态上可与末龄幼虫区分开来。
2. 根据均匀的乳白色体色（无明显变色或黑色素沉积）、体型（体长2−3 cm）、体重（约250 mg）、活跃的运动能力以及翻转后能自行恢复正位的能力，筛选健康幼虫用于实验。
3. 使用钝头镊子将健康幼虫（每组至少20−30只）小心转移至内铺滤纸（94/15 mm）的培养皿（94/15 mm）中，以尽量减少污染，并在室温避光条件下保存至使用。

3. 用 BCG lux 感染 G. mellonella

1. 尽量减少MSC内的杂乱物品，以降低污染和针刺伤的风险。
2. 通过将一张圆形滤纸（94 mm）粘贴到一个平坦的抬高表面上来准备注射平台。可使用软质或硬质表面，完全取决于使用者的偏好，例如移液器盒盖或尼龙清洁海绵。
3. 用25 µL微量注射器（25 G）吸取3倍体积的70%乙醇进行灭菌，并再用3倍体积的无菌PBS-T冲洗。
4. 将10 µL BCG lux 接种液（按第1节制备）或PBS-T吸入已灭菌的25 µL微量注射器中。PBS-T阴性对照应使用单独的注射器。
   注意：每注射10次后需重新混悬BCG lux 接种液，以确保细胞悬浮均匀。
5. 使用镊子夹取一只幼虫并将其放置在注射平台上。
6. 在平台上将幼虫翻转至背部，用镊子固定其头部和尾部以实现固定。从幼虫头部向下计数，定位左侧最后一对腹足，并以10−20°的角度将针尖（插入深度5−6 mm）小心刺入水平面。
   注意：短而窄的镊子便于固定，同时最小化幼虫应激。注意避免穿刺过深，以免刺破肠道，导致非BCG lux 特异性的黑色素沉积或死亡。
7. 将感染后的幼虫计数后放入一个内衬滤纸层的培养皿中，单个90 mm培养皿最多可容纳30只幼虫。
8. 将含有幼虫的培养皿存放在37 °C、5% CO₂ 的培养箱中，置于通风或非密封的暗盒内。

4. 感染后监测G. mellonella的存活情况

1. 在时间过程中，每24小时监测一次幼虫的存活情况。当幼虫受到触碰后无法移动时，即视为死亡。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 反应管（Eppendorf）	Eppendorf	22431021
20、200 和 1000 µl 移液器及滤芯吸头	任意供应商	n/a
24 孔培养板	Greiner	662160
25 ml 移液管和移液器辅助器	任意供应商	n/a
三室培养皿（94/15 mm）	Greiner	637102
离心机	任意供应商	n/a
II 级生物安全柜	任意供应商	n/a
带通气盖的锥形瓶（250 ml）	Corning	CLS40183
乙醇（>99.7%）	VWR	208221.321
Galleria mellonella（每包 250 只）	Livefood Direct UK	W250
甘油	Sigma-Aldrich	G5150
潮霉素 B	Corning	30-240CR
微量注射器（25 µl，25 号针头）	SGE	3000
微量离心机	任意供应商	n/a
Middlebrook 7H11 琼脂	BD Bioscience	283810
Middlebrook 7H9 肉汤	BD Bioscience	271310
Middlebrook ADC 增菌液	BD Bioscience	212352
Middlebrook OADC 增菌液	BD Bioscience	212240
Mycobacterium bovis BCG lux	多种来源	n/a
正癸醛（n-decyl aldehyde）	Sigma-Aldrich	D7384-100G
轨道摇床培养箱	任意供应商	n/a
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
吐温-80（Polysorbate 80）	Sigma-Aldrich	P8074-500ml
小盒子	任意供应商	n/a	推荐使用暗色、带通风孔或非密封的盒子
镊子	任意供应商	n/a	短而细尖/钝头长镊子
培养皿（94/15 mm）	Greiner	633181
滤纸（94 mm）	任意供应商	n/a	裁剪至合适尺寸