昆虫幼虫体内表达荧光素酶细菌负荷量的活体检测

摘要

来源：Asai, M. 等人， 无脊椎动物的使用 Galleria mellonella 作为研究感染的模型 结核分枝杆菌 复合物 视频实验杂志 (2019)

本视频展示了 体内 使用卡介苗（BCG）测量细菌负荷 lux感染昆虫幼虫后，通过幼虫匀浆、加入荧光素酶底物处理及生物发光检测，测定相对光单位，以评估细菌载量。

方案

注意：以下所述的所有操作均须在二级微生物安全柜（MSC）内的生物安全二级（CL2）实验室中进行，并遵循当地的健康与安全指南。

1. 准备 结核分枝杆菌牛型亚种 BCG lux 用于感染

1. 解冻一管含有15%甘油的冷冻保存的 Mycobacterium bovis 卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG） lux菌株，该菌株为蒙特利尔疫苗株，经改造后携带含有来自 Vibrio harveyi 的 luxAB 基因的穿梭质粒pSMT1，这些基因编码荧光素酶。
2. 在标记好的250 mL锥形瓶中，将1.2 mL解冻后的BCG lux菌液接种至15 mL Middlebrook 7H9液体培养基中，该培养基含有0.2%甘油、10%白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）增补剂以及50 µg/mL潮霉素。
3. 将锥形瓶置于密封的生物安全容器中，在37 °C、220 rpm条件下于振荡培养箱中培养72小时（或直至菌液达到对数生长期中期）。
4. 通过将菌液用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 反应管（Eppendorf）	Eppendorf	22431021
20、200 和 1000 µl 移液器及滤芯吸头	任意供应商	n/a
24 孔培养板	Greiner	662160
25 ml 移液管和移液器辅助装置（pipette boy）	任意供应商	n/a
三区培养皿（94/15 mm）	Greiner	637102
离心机	任意供应商	n/a
II 级生物安全柜	任意供应商	n/a
带通气盖的锥形瓶（250 ml）	Corning	CLS40183
乙醇（>99.7%）	VWR	208221.321
Galleria mellonella （每包 250 只）	Livefood Direct UK	W250
甘油	Sigma-Aldrich	G5150
均质器（FastPrep-24 5G）	MP Biomedicals	116005500
潮霉素 B	Corning	30-240CR
发光检测仪（Autolumat LB 953）	Berthold	34622
发光检测仪专用试管	Corning	352054
裂解基质（S 型，2.0 ml）	MP Biomedicals	116925500
微量注射器（25 µl，25 号针头）	SGE	3000
微量离心机	任意供应商	n/a
Middlebrook 7H11 琼脂	BD Bioscience	283810
Middlebrook 7H9 肉汤	BD Bioscience	271310
Middlebrook ADC 增菌液	BD Bioscience	212352
Middlebrook OADC 增菌液	BD Bioscience	212240
Mycobacterium bovis BCG lux	多种来源	n/a
正癸醛（n-decyl aldehyde）	Sigma-Aldrich	D7384-100G
轨道摇床培养箱	任意供应商	n/a
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
聚山梨酯 80（Tween-80）	Sigma-Aldrich	P8074-500ml
小盒子	任意供应商	n/a	推荐使用暗色、带通风孔或非密封的盒子
镊子	任意供应商	n/a	短而尖头/钝头长镊子
培养皿（94/15 mm）	Greiner	633181
滤纸（94 mm）	任意供应商	n/a	裁剪至合适尺寸