昆虫幼虫体内表达荧光素酶细菌负荷量的活体检测

摘要

来源：Asai, M. 等人， 无脊椎动物的使用 Galleria mellonella 作为研究感染的模型 结核分枝杆菌 复合物 视频实验杂志 (2019)

本视频展示了 体内 使用卡介苗（BCG）测量细菌负荷 lux感染昆虫幼虫后，通过幼虫匀浆、加入荧光素酶底物处理及生物发光检测，测定相对光单位，以评估细菌载量。

方案

注意：以下所述的所有操作均须在二级微生物安全柜（MSC）内的生物安全二级（CL2）实验室中进行，并遵循当地的健康与安全指南。

1. 准备 结核分枝杆菌牛型亚种 BCG lux 用于感染

1. 解冻一管含有15%甘油的冷冻保存的 Mycobacterium bovis 卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG） lux菌株，该菌株为蒙特利尔疫苗株，经改造后携带含有来自 Vibrio harveyi 的 luxAB 基因的穿梭质粒pSMT1，这些基因编码荧光素酶。
2. 在标记好的250 mL锥形瓶中，将1.2 mL解冻后的BCG lux菌液接种至15 mL Middlebrook 7H9液体培养基中，该培养基含有0.2%甘油、10%白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）增补剂以及50 µg/mL潮霉素。
3. 将锥形瓶置于密封的生物安全容器中，在37 °C、220 rpm条件下于振荡培养箱中培养72小时（或直至菌液达到对数生长期中期）。
4. 通过将菌液用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，含0.01 M磷酸盐缓冲液、0.0027 M氯化钾和0.137 M氯化钠）按1:10比例稀释，分别取两份加入发光仪检测管中，涡旋混匀后放入发光仪，以正癸醛（1% v/v溶于无水乙醇）为底物测定生物发光强度（相对光单位[RLU]/mL），以检测BCG lux 菌液的生长情况。
   注意： 既往研究已确定，当BCG lux 在Middlebrook 7H9液体培养基中体外培养时，RLU与菌落形成单位（CFU）的比值为3:1。
5. 在室温下以2,175 × g 离心10分钟，使菌体沉淀，弃去上清液并将其倒入具有已知抗分枝杆菌活性的适当消毒剂中。所有培养废弃物应按照当地规定，使用适用于分枝杆菌的消毒剂进行处理。
6. 用含0.05%吐温-80（PBS-T）的磷酸盐缓冲液将菌体沉淀清洗两次，以防止细菌聚集。
7. 最后一次清洗后，倾去废液上清，将分枝杆菌菌体沉淀重悬于PBS-T中，并根据RLU测定结果将菌悬液调整至所需细胞密度。
8. 使用PBS-T在24孔板中对接种物进行10倍系列稀释，取10 µL菌液双份点种于Middlebrook 7H11琼脂平板（含0.5%甘油、50 µg/mL潮霉素、10%油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶[OADC]）上，用于测定接种物的CFU数量。

2. 准备 G. mellonella 幼虫

1. 从合适的来源购买末龄幼虫，收到后在18 °C避光条件下饲养，并在购买后1周内使用。或者，可按照Jojāo等人的方案自行培育幼虫。对于购买的幼虫，在储存前应剔除任何死亡、变色或正在化蛹的个体。
   注意： 化蛹幼虫在形态上可与末龄幼虫区分开来。
2. 根据均匀的乳白色体色（无明显变色或黑色素沉积）、体型（体长2−3 cm）、体重（约250 mg）、活跃的运动能力以及翻转后能自行恢复正位的能力，筛选健康幼虫用于实验。
3. 使用钝头镊子将健康幼虫（每组至少20−30 条）小心计数后转移至已铺有滤纸（94/15 mm）的培养皿（94/15 mm）中，以尽量减少污染，并在室温避光条件下保存至使用。

3. 感染 G. mellonella 使用卡介苗（BCG） lux

1. 尽量减少MSC内的杂乱物品，以降低污染和针刺伤的风险。
2. 通过将一张圆形滤纸（94 mm）固定在平坦的抬高表面上来准备注射平台。可使用软质或硬质表面，具体选择完全取决于使用者偏好，例如移液器盒盖或尼龙百洁布。
3. 用25 µL微量注射器（25 G）吸取3个体积的70%乙醇进行灭菌，并用3个体积的无菌PBS-T进一步冲洗。
4. 将10 µL BCG lux 接种液（按第1节制备）或PBS-T吸入已灭菌的25 µL微量注射器中。PBS-T阴性对照应使用单独的注射器。
   注意： 每注射10次后，需重新混匀BCG lux 接种液，以确保细胞悬浮均匀。
5. 使用镊子夹取一只幼虫并将其放置在注射平台上。
6. 在平台上将幼虫翻转至背部朝上，用镊子固定其头部和尾部以实现固定。从幼虫头部向下数，定位最末左侧的腹足，并以10−20°的角度将针尖（插入深度5−6 mm）小心刺入水平面。
   注意： 短而窄的镊子便于固定，同时可最大程度减少幼虫应激。注意避免刺入过深，以免刺破肠道，导致非BCG lux 特异性的黑色素沉积或死亡。
7. 将感染后的幼虫计数后放入一个内衬滤纸层的培养皿中，单个90 mm培养皿最多可容纳30只幼虫。
8. 将含有幼虫的培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中，存放于通风或非密封的暗盒内。

4. 感染后 G. mellonella 存活情况的监测

1. 在时间过程中，每 24 小时监测一次幼虫的存活情况。当幼虫在受到触碰时无法移动，则视为死亡。

5. 测量 体内 卡介苗负担 lux 在 G. mellonella

1. 在每个时间点，随机选取第3部分中预先准备的五只感染幼虫，并用以下方法轻轻消毒幼虫表面 70% 乙醇浸泡的棉签         
   注意： 此步骤在对幼虫匀浆进行分枝杆菌菌落形成单位（CFU）计数时至关重要，因为未灭菌的幼虫可能导致污染。
2. 将幼虫 individually 置于含有 800 µL 无菌 PBS 的 2 mL 裂解基质管中。
3. 使用匀浆器以6.0 m/s的速度匀浆幼虫，持续60秒。
4. 将裂解管在3,500 x g下离心 g 5 秒，以去除管盖上的匀浆液，然后小心地将匀浆液分别倒入无菌的发光检测管中。
   注意： 进行菌落形成单位（CFU）计数（步骤 5.7）时，需在无菌的 1.5 mL 离心管中保留 100 µL 匀浆液。
5. 用1 mL PBS-T冲洗裂解基质管，以回收残留的匀浆液，并用移液器转移至相应的发光仪检测管中。
6. 涡旋混合发光仪管，测定步骤1.4中先前所述匀浆液的生物发光。
7. 在24孔培养板中，用PBS-T对匀浆液进行10倍系列稀释。取10 µL稀释液接种于含0.5%甘油、50 µg/mL潮霉素、10% OADC和20 µg/mL哌拉西林的Middlebrook 7H11琼脂平板，以测定BCG的RLU/CFU比值 lux 体内感染后
   注意： 哌拉西林可消除天然菌株 G. mellonella 微生态群对BCG的生长抑制最小 lux.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 反应管（Eppendorf）	Eppendorf	22431021
20、200 和 1000 µl 移液器及滤芯吸头	任意供应商	n/a
24 孔培养板	Greiner	662160
25 ml 移液管和移液器辅助装置（pipette boy）	任意供应商	n/a
三区培养皿（94/15 mm）	Greiner	637102
离心机	任意供应商	n/a
II 级生物安全柜	任意供应商	n/a
带通气盖的锥形瓶（250 ml）	Corning	CLS40183
乙醇（>99.7%）	VWR	208221.321
Galleria mellonella （每包 250 只）	Livefood Direct UK	W250
甘油	Sigma-Aldrich	G5150
均质器（FastPrep-24 5G）	MP Biomedicals	116005500
潮霉素 B	Corning	30-240CR
发光检测仪（Autolumat LB 953）	Berthold	34622
发光检测仪专用试管	Corning	352054
裂解基质（S 型，2.0 ml）	MP Biomedicals	116925500
微量注射器（25 µl，25 号针头）	SGE	3000
微量离心机	任意供应商	n/a
Middlebrook 7H11 琼脂	BD Bioscience	283810
Middlebrook 7H9 肉汤	BD Bioscience	271310
Middlebrook ADC 增菌液	BD Bioscience	212352
Middlebrook OADC 增菌液	BD Bioscience	212240
Mycobacterium bovis BCG lux	多种来源	n/a
正癸醛（n-decyl aldehyde）	Sigma-Aldrich	D7384-100G
轨道摇床培养箱	任意供应商	n/a
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
聚山梨酯 80（Tween-80）	Sigma-Aldrich	P8074-500ml
小盒子	任意供应商	n/a	推荐使用暗色、带通风孔或非密封的盒子
镊子	任意供应商	n/a	短而尖头/钝头长镊子
培养皿（94/15 mm）	Greiner	633181
滤纸（94 mm）	任意供应商	n/a	裁剪至合适尺寸