定量分析 幽门螺杆菌 加载感染的小鼠胃组织

摘要

来源：D'Costa, K. 等人， 小鼠模型 幽门螺杆菌 感染与胃部病理学 视频实验杂志 (2018)

在本视频中，我们介绍一种定量检测小鼠感染后胃组织中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）负荷量的实验方案，以确认其定植情况。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 感染后胃部细菌定植的确认

1. 胃内幽门螺杆菌（H. pylori）的活菌计数
   1. 在对感染小鼠胃组织进行菌落计数前，向无菌HBA平板中添加额外抗生素（200 μg/mL 杆菌肽和10 μg/mL 萘啶酸）。
   2. 使用可高压灭菌的聚丙烯微型研磨杵手动研磨胃组织样本，或使用机械解离仪（参见材料表）进行均质化处理。
   3. 将所得胃组织匀浆液用无菌BHI培养基进行连续倍比稀释（10⁻¹ 至 10⁻²）。
      注意：稀释倍数应根据所用特定H. pylori菌株在感染后通常获得的细菌载量以及感染持续时间来确定。也可使用未稀释样本。
   4. 将预先干燥的HBA平板（注意：为确保获得单菌落，使用前应在生物安全柜或37 °C培养箱中将HBA平板倒置加热并干燥10–15分钟）分为三或四个区域。采用改良的Miles和Misra法，将每种稀释液10–100 mL滴加至琼脂平板的一个区域，并用无菌塑料接种环涂布均匀。
   5. 待平板表面液体干燥后，将其倒置（盖子朝下）放入厌氧气体罐中。为保持罐内湿度，需放置一个含有水的培养皿。
   6. 将气体罐在37 °C条件下培养，直至菌落形成（通常为4–7天）。
   7. 计数含有10至100个独立菌落的区域。
      注意：可通过标准尿素酶、过氧化氢酶和氧化酶试验区分平板上H. pylori和H. felis的菌落与其他小鼠胃部微生物群成员的菌落。H. pylori和H. felis在这三项试验中均为阳性。
   8. 按以下公式计算细菌载量（CFU/g 组织）：
      [（平均菌落数）×（稀释倍数）×（涂布体积）] /（胃组织重量）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌学试剂
Oxoid 血琼脂基础培养基 No.2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	使用去离子水溶解，灭菌前备用
优质脱纤维马血	Australian Ethical Biologicals	PDHB100
Bacto 脑心浸液肉汤	BD Bioscience	237500	使用去离子水溶解，灭菌前备用
CampyGen 气体发生包	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
抗生素
万古霉素	Sigma Aldrich	V2002-1G	溶于去离子水中
多粘菌素 B	Sigma Aldrich	P4932-5MU	溶于去离子水中
甲氧苄啶（≥98% HPLC）	Sigma Aldrich	T7883	溶于100%（绝对）乙醇中
两性霉素	Amresco (Astral Scientific)	E437-100MG	溶于去离子水中
来自 Bacillus licheniformis 的杆菌肽	Sigma Aldrich	B0125	溶于去离子水中
萘啶酸	Sigma Aldrich	N8878	溶于去离子水中
仪器与塑料耗材
Oxoid 厌氧罐	Thermo Fischer Scientific	HP0011/HP0031
COPAN 巴斯德吸管	Interpath Services	200CS01
Eppendorf 5810R 离心机			在 4°C 条件下以 2,200 rpm 离心 10 分钟收集菌体沉淀
Parafilm M 封口膜	Bemis, VWR	PM996
适用于 1.2 - 2 mL 管的 Eppendorf 微型研磨杵	Sigma Aldrich	Z317314	可高压灭菌的聚丙烯研磨杵，用于胃组织匀浆
GentleMACs 组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-093-235	使用预设的 GentleMACS 程序处理小鼠胃组织
M 管（橙色盖）	Miltenyi Biotec	30-093-236
Qubit 荧光计	Thermo Fischer Scientific	Q33216
无菌塑料接种环	LabServ	LBSLP7202