经尿道插管与细菌接种建立雄性小鼠尿路感染模型

摘要

来源：Zychlinsky Scharff, A.，等。小型动物模型中的尿路感染：雄性和雌性小鼠的经尿道导管插入术。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了通过经尿道导管灌注在雌性小鼠膀胱中建立尿路致病性Escherichia coli感染的方法。注入的细菌可在膀胱内成功建立尿路感染，为研究与尿路相关的医疗相关疾病提供了有价值的实验平台。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 导管的制备

1. 为每组待感染的小鼠准备一个儿科静脉穿刺导管。按照制造商说明，利用内置弹簧装置将每个导管的针头卸下。丢弃针头，仅保留塑料静脉导管部分。
2. 在层流罩中对导管进行紫外线（U.V.）消毒一个周期，通常为 25 - 30 分钟。
   注意：导管可重复用于多只小鼠，但在不同实验组、不同性别或不同细菌菌株之间应使用新的导管。

2. 尿路致病性 E. coli 感染前的制备

1. 感染前至少两天，使用无菌接种环将UPEC从冷冻菌种接种至含有适当抗生素的Luria肉汤（LB）琼脂平板上。在37 °C下培养过夜。平板可在4 °C下保存最多一周。
2. 在100 ml无菌锥形瓶中，取LB琼脂平板上的单个菌落接种于10 ml含适当抗生素的LB液体培养基中，在37 °C静置培养过夜（约16–18小时）。
   注意：静置培养有利于表达I型菌毛，而I型菌毛是感染所必需的。振荡培养的菌液菌毛表达效率较低，从而导致感染率不稳定。
3. 测定过夜培养物在600 nm处的光密度（OD）₆₀₀，并利用预先确定的生长曲线计算每毫升细菌数量。例如，对于UPEC菌株UTI89，OD₆₀₀ = 0.35相当于每毫升2 × 10⁸ CFU，因此OD₆₀₀ = 2.4的过夜培养物相当于每毫升13.7 × 10⁸ CFU。每次使用新的感染菌株时，均应通过实验确定OD₆₀₀与活菌数之间的关系。
4. 根据拟感染动物数量确定所需细菌总量，每只小鼠需在50 μl PBS中接种约10⁷菌落形成单位（CFU）。计算时需考虑导管和注射器乳头约130 µl的死体积，以及用于测定接种量的100 µl额外体积。
   1. 将细菌悬液在台式微量离心机中以17,000 × g离心1分钟，弃上清，将菌体沉淀重悬于PBS中，调整浓度至每毫升2 × 10⁸ CFU。取部分悬液进行系列稀释，接种于含适当抗生素的LB琼脂平板，以确定每次感染的准确接种量。
5. 将细菌接种液吸入1 ml注射器中，并将导管连接至注射器末端。轻弹注射器以排除气泡，推动活塞以填充导管内的死腔空间，然后开始灌注操作。

3. 小鼠的准备

1. 麻醉小鼠 通过 腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg 赛拉嗪。可提供辅助加热。
2. 通过中等力度挤压小鼠足垫，确保每只小鼠已完全麻醉。当小鼠无反应时，表明其已完全麻醉，通常需要 3 - 5 分钟达到此状态。
3. 将小鼠仰卧放置，对下腹部施加中等压力以排空膀胱中的尿液。充盈的膀胱在髂嵴之间的皮下触感类似于一颗豌豆。
   注意：吸入式异氟烷已用于雌性小鼠的插管，但尚未验证吸入式异氟烷是否能使雄性小鼠在此操作中达到足够的麻醉效果。

4. 雄性小鼠的经尿道灌注

1. 用两把镊子分别夹住小鼠外生殖器的头侧和尾侧。向后退缩包皮，充分暴露阴茎头。当阴茎完全外露后，松开镊子。
2. 重新放置镊子，将突出的阴茎固定成与动物体垂直的位置，轻柔但稳固地夹持阴茎。观察尿道口，小心地将导管插入阴茎顶端的小开口中。轻柔地将导管沿阴茎向小鼠体内方向推进，同时用镊子保持轻微张力。导管无需润滑。切勿强行插入导管；导管应能顺畅滑入尿道，表明位置正确。
3. 当导管接头处到达阴茎尖端时，缓慢注入50 µl接种液，同时保持阴茎位置稳定。此时可根据预先设定的灌注质量评分标准（如图1所示）评估灌注质量。
4. 缓慢撤出导管，用约5秒时间完成，以防止接种液泄漏。将小鼠放回笼中，保持仰卧位。动物通常在麻醉给药后30–45分钟开始恢复。

结果

图1： 灌注质量与感染后24小时的细菌负荷无相关性。 6至8周龄的雌性和雄性C57Bl/6小鼠灌注10⁷ UPEC的菌落形成单位（CFU）。每次灌注后，由一名研究人员根据特定标准（框内文字）对灌注质量进行评分。感染后24小时，无菌摘除膀胱以测定细菌载量。图中显示了所评定的质量评分 与 CFU/膀胱。每个点代表一只小鼠，图中显示了5次合并的实验结果。p = 0.17，采用Kruskal-Wallis检验比较各组列均秩，事后多重比较采用Dunn's检验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Insyte Autoguard 防护型静脉导管 24 G，外径 0.7 mm，长 14 mM	BD Medical	381811 或 381411*	* 目录编号因国家而异
接种环	Greiner Bio-One	731171
注射器	B Braun	9166017V
持针钳（Adson）	Fine Science Tools	11006-12
胰岛素注射器	Terumo	BS05M2913
5 ml 聚丙烯离心管	Falcon	352063
LB Miller 肉汤	Difco	244620
LB Miller 琼脂	Difco	244520
比色皿	Bio-rad	223-9955