使用流式细胞术定量分析尿路致病性 E. coli 感染小鼠膀胱组织中的免疫细胞浸润

摘要

来源：Zychlinsky Scharff, A. 等，小型动物模型中的尿路感染：雄性和雌性小鼠的经尿道导管插入术。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们演示了一种基于流式细胞术的技术，用于定量CD45⁺ 免疫细胞在 大肠杆菌-感染小鼠膀胱以测量免疫细胞浸润。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会以及 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 膀胱组织的流式细胞术分析

1. 在 PBS 中配制含有 34 单位/mL 胶原酶和 100 µg/mL DNase 的消化缓冲液，置于冰上。为每只待分析的小鼠准备一个 15 ml 锥形管，并向每管中分装 1 ml 消化缓冲液。
2. 在预定时间点，按照批准的标准操作程序（例如，颈椎脱位或过量二氧化碳）处死小鼠。用 70% 乙醇充分润湿腹部，以最大限度减少毛发污染。
3. 使用剪刀在小鼠腹部下三分之一处做至少 2 cm 的切口，并取出整个膀胱。用剪刀充分剪碎，将膀胱切成 2–3 mm² 大小的组织块，通常约为 8 块。
   1. 将每份剪碎的膀胱组织加入含有消化缓冲液的管中。轻轻振荡，使组织沉入消化缓冲液中。所有膀胱组织解剖并剪碎前，均保持在冰上。
4. 将剪碎的膀胱组织在 37 °C 下孵育 60–75 分钟，每 15 分钟手动剧烈振荡 5 秒。当组织呈现玻璃样透明外观，类似湿的滤纸时，表明消化完成。过度消化会去除细胞表面用于鉴定的蛋白，应避免。
5. 通过加入 2–3 mL 冰冷的流式细胞术缓冲液（含 2% 胎牛血清（FBS）和 0.2 mM EDTA 的 PBS）来灭活消化酶，并轻轻混匀。将管子置于冰上。
6. 为确保获得单细胞悬液并去除任何结缔组织，将管内液体通过置于 15 mL 锥形管上的 100 µm 滤膜过滤。用注射器活塞末端轻轻压挤残留组织通过滤膜。再用额外 2 mL 流式细胞术缓冲液冲洗滤膜。样品保持在冰上。
7. 在 200 × g、4 °C 条件下离心 7 分钟以洗涤样品。将沉淀重悬于 100 µL 含 Fc 封闭剂的流式细胞术缓冲液中（稀释至 5 µg/mL），并转移至 96 孔圆底板中。10–15 分钟后，向每个样品中加入 100 µL 所需的抗体混合液。在冰上避光孵育 30–45 分钟。
   注意：Fc 封闭剂是一种用于防止抗体 Fc 段与表达 Fc 受体的细胞结合的试剂，其目的是减少非特异性抗体结合。所用抗体的选择取决于实验中待验证的假设，应参考文献并结合研究目的进行选择。在 图 1 中，为检测整体免疫细胞浸润情况，使用了抗 CD45 抗体，该抗体识别一种泛免疫细胞蛋白。
8. 在 200 × g、4 °C 条件下离心 7 分钟以洗涤样品。将细胞沉淀重悬于 200 µL 流式细胞术缓冲液中，并在上机前通过置于 5 ml 聚苯乙烯管上的 40 µm 细胞筛网过滤。
9. 在流式细胞仪上采集全部样品。良好的消化通常可从正常小鼠膀胱中获得 200,000–400,000 个细胞，其中 CD45⁺ 免疫细胞为 8,000–10,000 个，而感染器官中的细胞数量更多（图 1）。
   注意：用于流式细胞术分析的样品不能用于评估菌落形成单位（CFU）。不建议将膀胱一分为二进行处理，因为目前尚无证据表明尿路致病性 E. coli（UPEC）定植或免疫细胞浸润在组织中是均匀分布的。

结果

图 1： 尿路感染（UTI）后雌性小鼠的免疫细胞浸润增加。6至8周龄的雌性和雄性C57Bl/6小鼠经膀胱灌注或未灌注10⁷ CFU的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）。代表性散点图显示来自未处理或感染小鼠的膀胱总细胞，其中CD45⁺免疫细胞以粉红色圈选。该图展示了未处理或感染24小时后小鼠膀胱中CD45⁺免疫细胞的绝对数量。每个点代表一只小鼠，数据来自两次合并的实验。p值通过Mann-Whitney检验确定。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
注射器	B Braun	9166017V
持针钳（Adson）	Fine Science Tools	11006-12
5 mL 聚丙烯离心管	Falcon	352063
Tissue Ruptor 一次性探头	Qiagen	990890
15 mL 翻盖离心管	Thermo Scientific	362694
DNase	Invitrogen	18047019
100 µM MACS SmartStrainers	Miltenyi	130-098-463	适用于 15 mL 离心管，优先使用
100 µm 细胞滤筛	Falcon	352360	适用于 50 mL 离心管，若无 MACS SmartStrainers 时可使用
96 孔板	Falcon	353077
Fc 封闭剂	BD Pharmingen	553142	抗 CD16/CD32 抗体
抗小鼠 CD45 抗体	BD Biosciences	561487	提供多种不同的荧光标记选择
带滤膜盖的 5 mL 聚苯乙烯离心管	Falcon	352235
手持式匀浆器	Qiagen	9001272	TissueRuptor
流式细胞仪	BD Biosciences	N/A	Fortessa SORP
流式细胞分析软件	BD Biosciences	N/A	Diva