使用流式细胞术定量尿路致病性大肠杆菌感染小鼠膀胱组织中的免疫细胞浸润

摘要

来源:Zychlinsky Scharff， A. et al.， 小动物模型中的尿路感染:雄性和雌性小鼠的经尿道导管插入术。 （2017 年）

在本视频中，我们演示了一种基于流式细胞术的技术，用于定量大肠杆菌感染的小鼠膀胱中的 CD45⁺ 免疫细胞，以测量免疫细胞浸润。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 膀胱组织的流式细胞术分析

1. 在 PBS 中制备含有 34 单位/mL 胶原酶和 100 μg/mL DNase 的消化缓冲液。保持在冰上。每只待分析的动物准备一个 15 ml 锥形管，每管分装 1 ml 消化缓冲液。
2. 在预定的时间点，使用经批准的标准作程序（例如，宫颈脱位或二氧化碳过量）处死小鼠。用 70% 乙醇彻底润湿腹部，以尽量减少毛皮污染。
3. 用剪刀在小鼠腹部的下三分之一处切开至少 2 厘米，然后去除整个膀胱。用剪刀切碎，将膀胱切成 2 - 3 毫米² 大小的块，通常约为 8 块。
   1. 每管含有消化缓冲液，加入一个切碎的膀胱。摇晃以将切碎的膀胱组织洗入消化缓冲液中。放在冰上，直到所有膀胱都被解剖并切碎。
4. 将切碎的膀胱在 37 °C 下孵育 60 - 75 分钟，每 15 分钟用手剧烈摇动 5 秒。当组织具有玻璃状透明外观，类似于湿纸巾时，消化就完成了。长时间消化会从鉴定所需的细胞中去除表面蛋白，应避免使用。
5. 加入 2 - 3 mL 冰冷的流式细胞术缓冲液（含有 2% 胎牛血清 （FBS） 和 0.2 mM EDTA 的 PBS）灭活消化酶，并轻轻混匀。将试管放在冰上。
6. 为确保单细胞悬液并去除任何结缔组织，请将试管中的内容物通过放置在 15 mL 锥形管中的 100 μm 过滤器。用注射器柱塞的末端轻轻地将任何剩余的组织压入过滤器。用额外的 2 mL 流式细胞术缓冲液清洗过滤器。将样品放在冰上。
7. 通过在 200 x g 和 4 °C 下离心 7 分钟洗涤样品。将沉淀重悬于含有 Fc 块的 100 μL 流式细胞术缓冲液中，稀释至 5 μg/mL，然后转移到 96 孔圆底板中。10 - 15 分钟后，向每个样品中加入 100 μL 所需的抗体混合物。将样品在冰上避光孵育 30 - 45 分钟。
   注意:Fc 阻滞剂是一种用于防止抗体的 Fc 部分与表达 Fc 受体的细胞结合的试剂。其目的是最大限度地减少非特异性抗体结合。要使用的抗体的确定将取决于实验中正在测试的假设，并且应根据文献中的输入进行选择。在图 1 中，为了测量整体免疫细胞浸润，采用了抗 CD45 抗体，这是一种泛免疫细胞蛋白。
8. 通过在 200 x g 、4 °C 下离心 7 分钟洗涤样品。在 200 μL 流式细胞术缓冲液中重悬细胞沉淀，并在流式细胞仪上采集之前，将样品通过 5 ml 聚苯乙烯管上的 40 μm 细胞过滤器。
9. 在流式细胞仪上收集整个样品。良好的消化将产生 200,000 - 400,000 个细胞，其中 8,000 - 10,000 个 CD45⁺ 免疫细胞来自幼稚的小鼠膀胱，而受感染的器官将包含更多的细胞（图 1）
   注意: 为流式细胞术分析制备的样品不能用于评估 CFU。不建议将膀胱分成两部分，因为没有证据表明尿路致病性大肠杆菌 （UPEC） 定植或免疫细胞浸润在整个组织中是均匀的。

结果

图 1:雌性小鼠的免疫细胞浸润因 UTI 而增加。6 至 8 周龄的雌性和雄性 C57Bl/6 小鼠滴注或不滴注 10⁷ CFU 的 UPEC。代表性点图描绘了来自幼稚或感染小鼠的膀胱总细胞，其中 CD45 ⁺ 免疫细胞以粉红色门控。该图显示了幼稚或 24 小时感染小鼠膀胱中 CD45⁺ 免疫细胞的绝对数量。每个点是一只小鼠，并显示 2 个混合实验。由 Mann-Whitney 检验确定的 p 值。

材料