一种在离体器官培养中建立细菌感染模型的技术

摘要

来源：Rizzuto, G. A., 等. 研究母胎界面感染的人胎盘和蜕膜器官培养方法. J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种在胎盘组织中建立感染模型以研究感染传播的方法。ex vivo 胎盘器官培养物被单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）感染，该菌为一种兼性胞内寄生菌。细菌侵入绒毛外滋养层细胞（EVTs）进入胎盘组织，随后通过细胞间传播扩散至其他细胞。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 器官培养板的制备

注意：以下步骤应在生物安全柜中使用无菌技术进行操作。最好将解剖显微镜置于无菌区域内，但若无法实现，只要微解剖操作迅速完成，并且器械频繁浸入70%乙醇中，也可接受。

1. 将细胞外基质（ECM）小瓶置于冰上解冻。用预冷的收集培养基以1:1比例稀释ECM，并通过移液混匀。移液时应缓慢操作，避免产生气泡。每个6孔组织培养板的孔需要100 µl该悬浮液，可容纳3–4个器官培养物。
2. 将Transwell小室（孔径0.4 µm）放入6孔组织培养板的每个孔中。
3. 在每个Transwell小室上覆盖一层薄薄的ECM/培养基悬浮液（100 µl）。
4. 将培养板置于冰上，并立即开始建立器官培养。或者，可在组织采集前预先准备培养板，此时需用封口膜包裹后于4 °C保存以备后续使用。不建议保存超过6小时，否则ECM会干燥。

2. 器官培养体系的建立

注意：此步骤描述了如何将蜕膜器官培养物和绒毛器官培养物分别放置在不同的Transwell中。这些组织彼此不接触。若研究人员对使蜕膜与绒毛直接接触的共培养技术感兴趣，可参考先前的文献。

1. 用收集培养基将标本冲洗两次，每次冲洗之间以 1,000 × g 离心。将组织转移至无菌培养皿中，并置于解剖显微镜的载物台上。在显微镜旁的冰上放置一个6孔板。
2. 使用无菌弹簧解剖剪刀和镊子进行显微解剖，制备2–3 mm的绒毛器官培养物（图1A）。
   注意： 绒毛器官培养物为小型、血管化良好的“树状”结构，具有2或3个分支，并带有明显的细胞外绒毛滋养层（EVT）细胞柱。必须仅使用孕周 <9周的早孕期标本中的绒毛组织，因为在这些较早期的阶段，细胞外绒毛滋养层向细胞外基质（ECM）的侵袭最为显著。
3. 选择血管化良好且EVT细胞柱明显的绒毛。EVT细胞柱在显微镜下表现为膨大的、呈“毛绒状”或“蓬松状”的末端（参见 图1A 中的箭头所示）。
4. 使用无菌镊子将3至4个绒毛“树状”结构转移至每个Transwell小室中。调整分支方向，使“树状”结构平展地置于ECM表面，并将聚集的分支分开。
5. 使用无菌弹簧解剖剪刀和镊子对蜕膜组织进行显微解剖，制备3 mm³的蜕膜器官培养物（图1A）。
   注意： 标本包含两种不同类型的蜕膜组织，分别为壁蜕膜和包蜕膜（分别为 图1A 中的左侧和右侧组织碎片）。
6. 用剪刀修剪，制备3 mm³大小的壁蜕膜组织块。包蜕膜不用于此类培养。使用镊子分离并去除任何凝结的母体血液。
7. 使用无菌镊子将3–4块蜕膜组织转移至每个Transwell小室中。
8. 向孔底部加入1 ml收集培养基。将培养板在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。
9. 对于需要模拟正常早孕期胎盘氧张力的实验，应将绒毛器官培养物维持在相对低氧环境（3% O₂）中。
   注意： 实验室可选方案包括可置于常规培养箱内的小型低氧培养舱，或使用三气培养箱通过引入外部N₂气体以降低氧浓度。
10. 培养12–16小时后，向Transwell上室加入1 ml绒毛培养基或蜕膜培养基（表1）。
    注意： 培养初期过夜阶段不加培养基，以允许细胞外绒毛滋养层细胞柱发生侵袭（绒毛培养），并使组织（包括绒毛和蜕膜）牢固嵌入ECM中。根据我们的经验，蜕膜器官培养物可维持活性达72小时，绒毛器官培养物可达96小时。我们建议实验终点应在此时间范围内进行。绒毛和蜕膜培养基的组成详见 表1。绒毛培养基含有较高比例的胎牛血清（FBS），而蜕膜培养基则添加了维持蜕膜化状态的妊娠激素（孕酮、17β-雌二醇）（表1）。

3. 单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）培养物的制备

注意：有关单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）的长期保存，以及该生物体在脑心浸液（BHI）肉汤和琼脂中的培养与生长的详细方案，请参见 Wang et al.

1. 从划线接种的BHI琼脂平板上挑取单个L. monocytogenes菌落，接种于3 ml BHI液体培养基中。
2. 将L. monocytogenes培养物在30 °C条件下静置培养过夜（16小时）。
   注意：该培养条件可使细菌生长进入稳定期。L. monocytogenes在30 °C时具有鞭毛，有助于增强对宿主细胞的侵袭能力。

4. 器官培养物的感染 L. monocytogenes

1. 将磷酸盐缓冲液（PBS）和绒毛或蜕膜培养基（表 1）预热至 37 °C。
2. 使用无菌镊子移除未侵入细胞外基质因而漂浮在孔中的器官培养组织块。
3. 小心吸去 transwell 底部的培养基。通过轻轻向孔中加入 1 ml 预热的 PBS，轻柔吹打清洗上室和下室，重复两次，每次之间均小心吸除液体。然后，分别向 transwell 的上室和下室各轻柔加入 1 ml 不含抗生素的绒毛或蜕膜培养基。注意不要扰动器官培养组织。
4. 让组织在不含抗生素的培养基中孵育至少 1 小时，以确保抗生素被完全清除。
   注意： 在静止期，L. monocytogenes 培养物的密度约为每毫升 1 × 10⁹ 菌落形成单位（CFU）。用于感染器官培养物的细菌数量应根据实验需求通过经验确定。
5. 对于野生型 L. monocytogenes，常规感染实验表明，使用过夜培养菌液按 1:50 稀释（即每孔 1 ml 培养基中含 4 × 10⁷ 个 L. monocytogenes）可实现稳定的侵袭效果。将适量细菌重悬于不含抗生素的绒毛或蜕膜培养基中。
6. 吸除 transwell 上室中的培养基，轻柔加入 1 ml 接种液。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育，以允许细菌侵入。
7. 通过吸除上室和下室中的培养基以去除细胞外细菌。用预热的 PBS 清洗孔板两次。每孔加入 1 ml 含 50 µg ml^-1 庆大霉素的绒毛或蜕膜培养基。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。
   注意： L. monocytogenes 是一种兼性胞内细菌，可在细胞外培养基中生长，也可在细胞内增殖，并能在不进入细胞外空间的情况下实现细胞间传播。庆大霉素对细胞外的 L. monocytogenes 具有杀菌作用，因此可用于检测 L. monocytogenes 在器官培养组织内的胞内增殖与扩散。
   注意： 绒毛和蜕膜器官培养物中可重复的 L. monocytogenes 感染通常在孵育 5 小时后发生。在加入庆大霉素前的孵育时间可根据实验需求以及病原体侵入组织的能力进行调整。若需更准确地确定最易受感染的解剖部位，可采用较短的孵育时间。
8. 在整个实验过程中，将培养板维持在 37 °C、5% CO₂ 条件下。每天更换每孔中的全部培养基。
   注意： 根据我们的经验，感染 L. monocytogenes 的蜕膜器官培养物可保持活性达 48 小时，而绒毛器官培养物可维持活性达 72 小时。

表1：培养基配方。 洗涤缓冲液、收集培养基、绒毛培养基和蜕膜培养基的成分及浓度

洗涤缓冲液	收集培养基	绒毛培养基	蜕膜培养基
PBS	DMEM/F-12 with GlutaMAX	DMEM/F-12 with GlutaMAX	DMEM/F-12 with GlutaMAX
青霉素 100 IU/ml	胎牛血清 2.5%	胎牛血清 20%	胎牛血清 2.5%
链霉素 100 μg/ml	青霉素 100 IU/ml	青霉素 100 IU/ml	17β-雌二醇 300 pg/ml
庆大霉素 50 μg/ml	链霉素 100 μg/ml	链霉素 100 μg/ml	孕酮 20 ng/ml
两性霉素 B 1.25 μg/ml	庆大霉素 50 μg/ml
	两性霉素 B 1.25 μg/ml

结果

图1： 绒毛器官培养物——代表性大体及显微图像。

（A）在解剖显微镜下观察到的两个终末绒毛树，孕龄为6周。注意“绒毛状”末端（箭头所示）以及左侧绒毛树枝状结构中明显的胎儿血管系统，表明该组织适合用于器官培养。（B）孕龄8.3周的绒毛组织在感染单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）72小时后进行器官培养的免疫荧光显微镜图像，显示细胞外绒毛滋养层细胞中存在大量细菌[绿色]。DAPI染色呈蓝色，βHCG阳性合体滋养层细胞呈红色。比例尺 = 1 mm（A），250 µm（B）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
灭菌袋	Fisher Scientific	01-812-54	用于个体解剖工具的高压灭菌
细网筛	Cuisinart (Amazon.com)	NA	使用前用铝箔完全包裹，并在组织采集前进行高压灭菌。
带龙头的大容量瓶	Fisher Scientific	03-007-647	用于大量制备洗涤缓冲液。
冰袋	Nortech labs	GB8818	无需专门购买，可从常规实验室运输中回收/重复使用含有冰袋的包装。
70% 乙醇	VWR	V1001	通过向190或200 proof的研究级乙醇中加入dH₂O配制70%溶液。
10% 漂白剂	Waxie Sanitary Supply	CLO 30966	通过加入dH₂O配制10%溶液。
光源箱	Litebox Lumina (dickblick.com)	55305-2009	注意替换灯泡也可在Blick网站购买（55305.0100）
显微解剖镊	Stoelting	52102-43	4英寸，1×2，0.5毫米，轻微弯曲
显微解剖镊	Stoelting	52102-06	4英寸，直头精细，尖锐
显微解剖Vannas弹簧剪	Stoelting	52130-01P	McPherson-Vannas弹簧剪，8.5厘米，0.33毫米尖端，轻微弯曲
解剖显微镜	Leica Microsystems	MZ16 或 M60	我们使用所列型号取得了良好效果。外部鹅颈式柔性光源有帮助，但非必需。
50 mL 锥形管	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS4558
磷酸盐缓冲液	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	我们从大学组织培养核心设施采购，也可选择此类替代产品。
10X 磷酸盐缓冲液	Teknova	P0195	用于制备洗涤缓冲液时使用10X PBS
含GlutaMAX的DMEM/F-12营养混合物（Ham's）	Gibco (Life Technologies)	10565-018	我们采购此特定培养基配方，含有2.438 g/L碳酸氢钠、55 mg/L丙酮酸钠和4.5 g/L葡萄糖
庆大霉素	Thermofisher Scientific	15710072	1000X 储存液。建议分装并储存在-20 °C，避免冻融循环。
青霉素/链霉素	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100X 储存液。建议分装并储存在-20 °C，避免冻融循环。
两性霉素B	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15290-018	500X 储存液。建议分装并储存在-20 °C，避免冻融循环。
孕酮	Sigma-Aldrich	P8783	通过将15.7 mg孕酮粉末溶于15.7 mL乙醇，再加入34.3 mL PBS，配制1 mM储存液。溶液经无菌过滤、分装后于-20 °C保存。
17β-雌二醇	Sigma-Aldrich	E2758	通过将13.5 mg雌二醇粉末溶于10 mL乙醇，再加入40 mL PBS，配制10 μM储存液。溶液经无菌过滤、分装后于-20 °C保存。
瓶顶真空滤器（0.22 μm）	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430769	用于培养基配制后的无菌过滤
6孔组织培养板	BD Falcon	353224	聚苯乙烯，组织培养处理
6孔Transwell插件	Millipore	PICM03050	插入式，直径30 mm，0.4 μm孔径亲水性PTFE膜
细胞外基质（例如Matrigel基质）	BD Biosciences	354234	我们在研究中使用了Matrigel基质。该基质在室温和-20 °C下呈固态。避免反复冻融。在4 °C下将其融化为粘稠液体，并在低温环境中使用预冷的移液枪头分装约300 μL。分装后储存在-20 °C。
多聚甲醛，16% w/v 水溶液	Alfa Aesar	30525-89-4	用于组织固定，使用PBS稀释该储存液，新鲜配制4%多聚甲醛。
组织培养孵箱，维持在37 °C、5% CO2、3% 氧气（适用于绒毛类器官培养，可选）			某些实验可能更倾向于低氧条件。可通过多种方式建立低氧环境，包括通过气瓶、Tygon管和调节器加入外源性氮气。
台式离心机