一种在离体器官培养中建立细菌感染模型的技术

摘要

来源：Rizzuto, G. A., 等. 研究母胎界面感染的人胎盘和蜕膜器官培养方法. J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种在胎盘组织中建立感染模型以研究感染传播的方法。ex vivo 胎盘器官培养物被单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）感染，该菌为一种兼性胞内寄生菌。细菌侵入绒毛外滋养层细胞（EVTs）进入胎盘组织，随后通过细胞间传播扩散至其他细胞。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 器官培养板的制备

注意：以下步骤应在生物安全柜中使用无菌技术进行操作。最好将解剖显微镜置于无菌区域内，但若无法实现，只要微解剖操作迅速完成，并且器械频繁浸入70%乙醇中，也可接受。

1. 将细胞外基质（ECM）小瓶置于冰上解冻。用预冷的收集培养基以1:1比例稀释ECM，并通过移液混匀。移液时应缓慢操作，避免产生气泡。每个6孔组织培养板的孔需要100 µl该悬浮液，可容纳3–4个器官培养物。
2. 将Transwell小室（孔径0.4 µm）放入6孔组织培养板的每个孔中。
3. 在每个Transwell小室上覆盖一层薄薄的ECM/培养基悬浮液（100 µl）。
4. 将培养板置于冰上，并立即开始建立器官培养。或者，可在组织采集前预先准备培养板，此时需用封口膜包裹后于4 °C保存以备后续使用。不建议保存超过6小时，否则ECM会干燥。

2. 器官培养体系的建立

注意：此步骤描述了如何将蜕膜器官培养物和绒毛器官....

结果

图1： 绒毛器官培养物——代表性大体及显微图像。

（A）在解剖显微镜下观察到的两个终末绒毛树，孕龄为6周。注意“绒毛状”末端（箭头所示）以及左侧绒毛树枝状结构中明显的胎儿血管系统，表明该组织适合用于器官培养。（B）孕龄8.3周的绒毛组织在感染单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）72小时后进行器官培养的免疫荧光显微镜图像，显示细胞外绒毛滋养层细胞中存在大量细菌[绿色]。DAPI染色呈蓝色，βHCG阳性合体滋养层细胞呈红色。比例尺 = 1 mm（A），250 µm（B）。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
灭菌袋	Fisher Scientific	01-812-54	用于个体解剖工具的高压灭菌
细网筛	Cuisinart (Amazon.com)	NA	使用前用铝箔完全包裹，并在组织采集前进行高压灭菌。
带龙头的大容量瓶	Fisher Scientific	03-007-647	用于大量制备洗涤缓冲液。
冰袋	Nortech labs	GB8818	无需专门购买，可从常规实验室运输中回收/重复使用含有冰袋的包装。
70% 乙醇	VWR	V1001	通过向190或200 proof的研究级乙醇中加入dH₂O配制70%溶液。
10% 漂白剂	Waxie Sanitary Supply	CLO 30966	通过加入dH₂O配制10%溶液。
光源箱	Litebox Lumina (dickblick.com)	55305-2009	注意替换灯泡也可在Blick网站购买（55305.0100）
显微解剖镊	Stoelting	52102-43	4英寸，1×2，0.5毫米，轻微弯曲
显微解剖镊	Stoelting	52102-06	4英寸，直头精细，尖锐
显微解剖Vannas弹簧剪	Stoelting	52130-01P	McPherson-Vannas弹簧剪，8.5厘米，0.33毫米尖端，轻微弯曲
解剖显微镜	Leica Microsystems	MZ16 或 M60	我们使用所列型号取得了良好效果。外部鹅颈式柔性光源有帮助，但非必需。
50 mL 锥形管	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS4558
磷酸盐缓冲液	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	我们从大学组织培养核心设施采购，也可选择此类替代产品。
10X 磷酸盐缓冲液	Teknova	P0195	用于制备洗涤缓冲液时使用10X PBS
含GlutaMAX的DMEM/F-12营养混合物（Ham's）	Gibco (Life Technologies)	10565-018	我们采购此特定培养基配方，含有2.438 g/L碳酸氢钠、55 mg/L丙酮酸钠和4.5 g/L葡萄糖
庆大霉素	Thermofisher Scientific	15710072	1000X 储存液。建议分装并储存在-20 °C，避免冻融循环。
青霉素/链霉素	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100X 储存液。建议分装并储存在-20 °C，避免冻融循环。
两性霉素B	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15290-018	500X 储存液。建议分装并储存在-20 °C，避免冻融循环。
孕酮	Sigma-Aldrich	P8783	通过将15.7 mg孕酮粉末溶于15.7 mL乙醇，再加入34.3 mL PBS，配制1 mM储存液。溶液经无菌过滤、分装后于-20 °C保存。
17β-雌二醇	Sigma-Aldrich	E2758	通过将13.5 mg雌二醇粉末溶于10 mL乙醇，再加入40 mL PBS，配制10 μM储存液。溶液经无菌过滤、分装后于-20 °C保存。
瓶顶真空滤器（0.22 μm）	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430769	用于培养基配制后的无菌过滤
6孔组织培养板	BD Falcon	353224	聚苯乙烯，组织培养处理
6孔Transwell插件	Millipore	PICM03050	插入式，直径30 mm，0.4 μm孔径亲水性PTFE膜
细胞外基质（例如Matrigel基质）	BD Biosciences	354234	我们在研究中使用了Matrigel基质。该基质在室温和-20 °C下呈固态。避免反复冻融。在4 °C下将其融化为粘稠液体，并在低温环境中使用预冷的移液枪头分装约300 μL。分装后储存在-20 °C。
多聚甲醛，16% w/v 水溶液	Alfa Aesar	30525-89-4	用于组织固定，使用PBS稀释该储存液，新鲜配制4%多聚甲醛。
组织培养孵箱，维持在37 °C、5% CO2、3% 氧气（适用于绒毛类器官培养，可选）			某些实验可能更倾向于低氧条件。可通过多种方式建立低氧环境，包括通过气瓶、Tygon管和调节器加入外源性氮气。
台式离心机