疟疾-HIV共感染体外细胞培养模型的建立

来源：Finney, C. 等一个体外疟疾与HIV共感染背景下免疫应答检测模型。 视频实验杂志 (2015)

本视频演示了生成一个体外疟疾-HIV 共感染细胞培养模型。HIV 感染的外周血单个核细胞与 恶性疟原虫 受感染的红细胞可能相互支持其生长，并为HIV与疟疾共感染中的免疫反应及疾病进展提供见解。

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

警告：处理人类血液样本和人类疟原虫需要采取预防措施。必须穿戴实验服和手套，并在二级生物安全柜内操作。若发生意外经皮肤暴露于人类疟原虫的情况，须立即向健康与安全部门报告，以接受预防性治疗。处理人类免疫缺陷病毒（HIV阳性）血液时，还需采取额外的安全防护措施。应穿戴背后系扣的实验服，佩戴双层手套（外层手套应为乳胶材质），所有操作均须在二级生物安全柜内进行。禁止使用任何玻璃器皿或尖锐物品，禁止使用抽吸装置。所有被污染的物品在丢弃前，必须置于Virox溶液或漂白剂中浸泡至少1小时。使用后，所有工作表面须用Virox擦拭，并用紫外线（UV）照射消毒1小时。请注意，各机构均有各自特定的生物安全规定，必须严格遵守。若发生HIV感染血液的意外暴露，须立即向健康与安全部门报告，以便评估是否需要进行暴露后预防治疗。

注意：存在不同品系的P. falciparum疟原虫。本实验使用了ITG品系，但也可使用其他不同品系。有关冻存和复苏Plasmodium falciparum寄生虫的详细操作指南，可访问MR4网站获取。

1. 制备疟原虫培养用 RPMI-A 培养基

通过混合950 ml双蒸水（ddH₂O）、1包RPMI-1640粉末（Roswell Park Memorial Institute）、6 g N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）、2 g碳酸氢钠和1.35 mg次黄嘌呤，配制RPMI-0。
解冻两位不同供体的热灭活人血清。AB型供体血清最佳，但如果在O型红细胞（RBC）中培养寄生虫，则可使用任意血型的血清。颠倒混匀试管。若血清中存在颗粒物或黏稠，可在2,000 rpm离心，然后使用0.45 µm滤器过滤液体部分。
使用0.2 µm滤器过滤180 ml RPMI-0、20 ml人血清（每位供体各10 ml）和0.5 ml 10 mg/ml庆大霉素。
注意：人血清可能堵塞滤器，因此可能需要使用多个滤器单元。
在培养基瓶上标记RPMI-A、日期及血清来源。冷藏备用。RPMI-A在冷藏时可能变浑浊，此现象正常；但浑浊度持续增加则提示污染。
注意：不同供体血清中的寄生虫生长情况可能存在差异。建议在使用前对所有人血清批次进行测试，以确认其支持寄生虫良好生长的能力。

2. 寄生虫培养用人红细胞的制备

注意： 血液捐献者应为 O 型血。

将 7-10 ml 血液采集至含酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）的采血管中。在标签上注明供体编号及采血日期。
将血液储存于 4 ^oC，待需要时使用。用于寄生虫培养的血液应在 1 个月内使用。
用 70% 乙醇擦拭管盖顶部，小心移除塞子并丢弃。将血液转移至 15 ml 离心管中，以 1,000 × g 离心 3 分钟。通过抽吸去除血浆。
用等体积的预温 RPMI-0 重悬红细胞，以 1,000 × g 离心 5 分钟。抽吸去除白膜层，将红细胞重悬于 5 ml RPMI-0 中，并重复洗涤 2 次。
去除上清液，加入足量 RPMI-A，制备成体积分数为 50% 红细胞的悬液。
储存于 4 ^oC，待需要时使用。

3. 维持寄生虫培养

将RPMI-A预热至37 ^oC。
将已解冻的寄生虫（解冻步骤参见MR4操作规程）放入T25培养瓶中，加入5 ml RPMI-A和75 μl洗涤后的人类红细胞（RBC），使红细胞压积约为3%。注意：红细胞压积用于衡量红细胞体积占总体积的比例。计算方法为：将压积红细胞体积除以培养基与红细胞总体积。假设解冻后的寄生虫相当于提供75 μl红细胞。通过向培养瓶中加入150 μl红细胞储备液（相当于75 μl压积红细胞），则总红细胞体积为150 μl，加入5 ml培养基中，红细胞压积为3%（150 μl / 5,000 μl × 100% = 3%）。
用寄生虫专用混合气体（1% O₂、3% CO₂，其余为N₂）对培养瓶充气30秒。密封后将培养瓶平放于37 ^oC培养箱中，以增大气体交换的表面积。
更换培养基并检测寄生率时（需每日进行），小心移动培养瓶，避免扰动红细胞层。使用无菌未塞橡胶头的巴斯德吸管，吸取培养液，注意勿扰动血细胞层。
为检测寄生率，从血细胞层中取出10 μl样品，置于载玻片上，并用另一张盖玻片制备薄血膜。让玻片自然干燥。
向培养瓶中加入4 ml新鲜RPMI-A，轻轻混匀，充气30秒，置于37 °C培养箱中。
按照Hema3染色试剂盒的生产商说明书对玻片进行染色。
1. 为获得最佳染色效果，将玻片依次浸入固定液10秒，溶液I中10秒，溶液II中30秒。用清水冲洗后晾干。
通过计数感染Plasmodium falciparum的红细胞（PfRBC，呈深紫色）与总红细胞数（呈粉红色）的比例来计算寄生率。总计数300个细胞以确保准确性。
当寄生率达到5%时，将培养物扩增至T75培养瓶中，加入40 ml RPMI-A和500 μl红细胞。

4. 寄生虫同步化

注意： 实验前一天，通过添加丙氨酸处理寄生虫培养物以实现同步化。此处理仅环状体阶段的寄生虫和未感染的红细胞能够存活。丙氨酸同步化处理可在次日获得纯化的滋养体培养物，可用于共培养实验。务必从主要含有环状体阶段寄生虫的培养物开始。

将8.01 g丙氨酸（300 mM）和0.365 g Tris（10 mM）溶于300 ml去离子水（ddH₂O）中，配制丙氨酸溶液。调节pH至7.4。使用0.2 μm滤器过滤除菌。
将丙氨酸溶液预热至37 ^oC。
离心寄生虫培养物（5分钟 × 1,000 × g），弃去上清液。
用19体积的丙氨酸溶液重悬沉淀（1 ml压积红细胞加19 ml丙氨酸溶液）。室温（RT）孵育15分钟。
以5分钟 × 1,000 × g离心，吸除上清液。用RPMI-0洗涤一次，吸除上清液后重悬于RPMI-A中，并将血细胞比容调整至约3%。通入混合气体后置于37 ^oC培养。
注意： 进行共培养实验时，需至少含有5%的滋养体寄生率，以达到10%寄生率为最佳。

5. 共培养实验用寄生虫和红细胞的制备

在共培养实验中，使用每3个感染疟原虫的红细胞（PfRBC）对应1个外周血单个核细胞（PBMC）的比例，以诱导炎症反应。为计算PfRBC总数，需通过3.5节所述方法制备薄血涂片以定量寄生率，并使用血细胞计数板计数每毫升培养物中红细胞（RBC）的数量以确定血细胞比容（hematocrit）。
PfRBC总数 = 寄生率百分比 × 每毫升总RBC数 × 培养物体积（ml）。例如，10 ml培养物，RBC浓度为10 × 10⁶ 个/ml，寄生率为10%，则PfRBC总数为 0.1 × 10⁶/ml × 10 ml = 10 × 10⁶ 个PfRBC。
将疟原虫培养物在1,000 × g条件下离心5分钟（室温）。吸除上清液，用RPMI-S+培养基重悬，使PfRBC浓度为6 × 10⁶ 个/ml（RPMI-S+配方：500 ml RPMI-1640，添加L-谷氨酰胺和HEPES，10%热灭活胎牛血清（FBS），1.5 ml庆大霉素，5 ml 100 mM丙酮酸钠，5 ml 10 mM MEM非必需氨基酸，5 ml 5 mM β-巯基乙醇）。
取对照血液（用于维持疟原虫培养的同一供体的未感染RBC），计算血细胞比容，并用RPMI-S+培养基重悬，使其RBC浓度与疟原虫培养物中的RBC浓度相同（个/ml）。

6. 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离

从慢性 HIV(+) 供体和 HIV(-) 对照中分别采集静脉血至含肝素钠的试管（绿色管帽）中。不要使用乙二胺四乙酸（EDTA）作为抗凝剂，因为 EDTA 的钙螯合作用会影响细胞功能。通常每 10 ml 血液可获得 5–10 × 10⁶ 个 PBMC。典型实验中，从每位供体采集 30 ml 血液。具体血量需根据实验需求进行调整。
采血后应尽快操作，且必须在 1 小时内完成，将血液从试管中取出并转移至一个 50 ml 塑料离心管中。单核细胞特别容易被激活并黏附于玻璃表面，因此若使用玻璃采血管，必须尽快将细胞转移出来。
以 1,000 × g 离心 15 分钟，收集血浆（如需可用于其他研究；若不需要，此步骤可省略）。用等体积的冷 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释血液。
在 50 ml 离心管中加入 15 ml 室温 Ficoll 液。使用无菌塑料移液管，缓慢将血液/DPBS 溶液叠加在 Ficoll 液面上，避免混合。每 15 ml Ficoll 液最多可叠加 25 ml 血液/DPBS 溶液。
将密度梯度液在室温下以 600 × g 离心 30 分钟。确保离心机设置为“无刹车”模式。
离心完成后，观察两相之间的界面，PBMC 即位于此界面处。使用无菌塑料移液管从界面处收集 PBMC（见图 1），尽量减少红细胞的污染。
将收集的细胞置于 50 ml 离心管中，每管不超过 20 ml。用无菌冷 DPBS 加至 50 ml。
在 4 ^oC 下以 300 × g 离心 10 分钟。
弃去上清液，将沉淀用 5 ml 无菌冷 DPBS 重悬，并将同一供体的所有细胞合并至同一管中。用无菌 DPBS 加至 50 ml，重复洗涤步骤共 3 次（包括本次）。
用 10 ml RPMI-S+ 培养基重悬细胞。
取 20 μl 细胞悬液与 20 μl 台盼蓝混合。用移液器取 10 μl 加入血细胞计数板，计数活细胞（未摄入蓝色染料的细胞——所有蓝色细胞均为死细胞）。使用血细胞计数板按以下方法计算溶液中的细胞数量。
注意： 血细胞计数板具有特定尺寸的网格，因此线条所覆盖的面积是已知的。
1. 确保血细胞计数板清洁。将盖玻片覆盖在计数区域上。通过将移液器尖端插入 V 形加样口，加入 10 μl 细胞悬液。盖玻片下方区域将通过毛细作用自动充满液体。
2. 将加样后的血细胞计数板置于显微镜下观察。整个计数板网格包含 9 个 1 mm² 的大方格。计数每个大方格内的所有细胞。若细胞密度过高，需进一步稀释后重新计数。
3. 按以下公式计算细胞浓度：总细胞数/ml =（计数的总细胞数/计数的方格数）× 稀释倍数 × 10,000 个细胞/ml，例如，（500 个细胞/5 个方格）× 20 倍稀释 × 10,000 个细胞/ml = 20 × 10⁶ 个总细胞。
用 RPMI-S+ 培养基将细胞浓度调整至最终浓度为 10 × 10⁶ 个/ml。

7. 疟疾/HIV 共感染培养

将100 μl分离的外周血单个核细胞（PBMC）和400 μl RPMI-S+培养基加入24孔板中（每孔含1 × 10⁶个PBMC）。确保每个条件设置三个复孔：3孔加入未感染红细胞（RBC），3孔加入疟原虫感染的红细胞（PfRBC），3孔仅加入培养基，以及3孔加入佛波酯/离子霉素（PMA/Ionomycin）。HIV阳性（HIV(+)）和HIV阴性（HIV(-)）样本均需如此设置。
对于PfRBC孔，每孔加入3 × 10⁶个PfRBC（即5.2步骤中制备的500 μl寄生虫培养物）。
对于未感染RBC孔，每孔加入5.3步骤中制备的500 μl未感染RBC培养物。
对于培养基对照孔，每孔加入500 μl RPMI-S+培养基。
对于PMA/Ionomycin孔，配制PMA/Ionomycin溶液（终浓度分别为2.5 pg/ml和250 pg/ml），每孔加入500 μl该溶液。
注意： PMA和Ionomycin是T细胞细胞因子分泌的强效刺激剂，作为阳性对照使用，以确认细胞功能正常。
将培养板置于37 ^oC、5% CO₂的培养箱中孵育。
可选步骤： 若有剩余细胞，可用于流式细胞术进行表型分析，或将其保存于RNA稳定化溶液中，以备后续mRNA表达分析。

8. 疟疾免疫应答的检测

注意：共培养实验最长可持续4天，此期间无需更换培养基。最佳时间点取决于所研究的细胞类型及具体科学问题。对于单核细胞对疟原虫感染红细胞（PfRBCs）的反应，12–48小时的孵育时间为最佳；而淋巴细胞反应则在72–96小时观察效果最佳。具体时间点应根据实验目的进行优化。若关注完整疟原虫感染红细胞与外周血单个核细胞（PBMCs）之间的相互作用，可采用较短时间（2–4小时）。

以 300 × g 离心 3 分钟，使细胞沉淀。从每个孔中收集 700 μl 培养上清液。
以 1,000 × g 离心上清液 5 分钟，去除任何碎片。
根据需要分装澄清的上清液，标记后于 -20 °C 以下冷冻，直至进行分泌因子的检测。

姓名	公司	目录编号	评论
丙氨酸	Sigma	A7377
BD Vacutainer ACD 溶液 A	BD	364506
BD Vacutainer 肝素钠	BD	17-1440-02
DPBS（无钙、无镁）	Corning	21-031-CV
胎牛血清	Sigma	F1051	使用前需热灭活
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
庆大霉素（10 mg/mL）	Gibco	15710-064
Hema3 染色试剂盒	Fisher	122-911
HEPES	Fisher	BP310-500
次黄嘌呤	Sigma	H9636
离子霉素	Sigma	I3909
MEM 非必需氨基酸（10 mM）	Gibco	11140
PMA	Sigma	P8139
RPMI-1640 粉末	Life-Technologies	31800-022
含 L-谷氨酰胺和 HEPES 的 RPMI-1640	Thermo Scientific	SH30255.01
碳酸氢钠（粉末，细胞培养级）	Sigma	S5761
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	11360
Tris（Trizma 碱）	Sigma	T6066
Trizol	Ambion	15596018
台盼蓝（0.4%）	Gibco	15250-061
寄生虫气体混合物	特殊订购		3% CO2, 1% O2, 余量为 N2

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