通过同种异体骨髓与脾细胞移植在小鼠模型中诱导移植物抗宿主病

摘要

来源：Buchele, V., 等. 小鼠体内肠道移植物抗宿主病的诱导及其微型内镜活体评估. J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了如何利用同种异体造血干细胞和可诱导移植物抗宿主病（GvHD）的脾源性异反应性T淋巴细胞，在经致死剂量照射的受体小鼠中诱导肠道移植物抗宿主病。该实验方案有助于建立严重的急性肠道GvHD模型，以深入理解该疾病的发病机制，并开发创新的治疗策略。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 移植物抗宿主病（GvHD）诱导

1. 第0天: 受体小鼠的全身照射
   1. 使用至少10周大的雌性CD45.2+ H2kd+ BALB/c小鼠作为受体。
   2. 称重并记录受体小鼠在诱导移植物抗宿主病（GvHD）前的体重。
      注意： 确保受体小鼠的体重不低于20 g。初始体重将作为参考值，用于计算单只小鼠在移植物抗宿主病（GvHD）诱导和进展过程中的体重下降情况。
   3. 将最多五只小鼠放入X射线辐照仪的容器中。
   4. 采用8 Gy单次剂量的X射线对小鼠进行全身照射。使用Cs137作为辐射源。
2. 第1天：用去T细胞骨髓重建经辐照的小鼠
   注意： 同种异体骨髓细胞的移植应于照射后24小时内进行，具体操作详见第1.2节。以下步骤需在无菌细胞培养超净台中进行，并使用经过滤的试剂。采用同种异体CD45.1/Ly5.1 B6.SJL-Ptprca Pepcb以/BoyCrl小鼠作为T细胞耗竭骨髓的供体。
   1. 根据机构指南，在受体 BALB/c 小鼠照射后 12–24 小时，处死将用于捐献同种异体骨髓细胞的 CD45.1/Ly5.1 B6.SJL 小鼠。操作时，通过吸入 5% 异氟烷对 CD45.1/Ly5.1 B6.SJL 小鼠进行麻醉，在呼吸停止后继续暴露于异氟烷超过 1 分钟，并通过颈椎脱位确认动物死亡。
   2. 用70%乙醇彻底消毒小鼠的毛发和皮肤。
   3. 将小鼠置于干净的操作套管上，使其呈俯卧位，尾部朝向实验操作者。用长度为13 cm、具有锯齿状弯曲尖端的Semken镊轻轻提起跟腱部位的毛发。用8.5 cm长、直头硬化精细剪刀，在镊子与足跟之间的位置切开皮肤。
   4. 将切口向头侧延长（即从足跟部经下肢和大腿至髋部区域）。借助镊子去除后肢的皮肤和毛发。
   5. 对另一侧后肢执行相同的步骤。
   6. 通过切断相邻的髋关节去除后肢。
   7. 剪除后肢足部，沿膝关节处切断。将每侧后肢的大腿和小腿部分合并，置于盛有磷酸盐缓冲液（PBS）并置于冰上的92 mm培养皿中保存。
   8. 小心清理股骨和胫骨，尽可能去除每条大腿和小腿上的肌肉组织。将股骨和胫骨转移至含有无菌RPMI 1640培养基的50 mL离心管中，并置于湿冰上，直至完成1.2.7步骤中收集的所有胫骨和股骨的肌肉组织清除。
   9. 为分离骨髓，将经过步骤1.2.8所述方法清理后的股骨或胫骨一次一根地从50 mL离心管转移至盛有RPMI 1640培养基的培养皿（直径92 mm）中。用手术刀切除股骨或胫骨两端，以暴露含有骨髓的骨腔。
   10. 在50 mL离心管中加入5 mL RPMI 1640培养基。将连接有1 mL RPMI 1640培养基的1 mL注射器（装有26 G针头）插入骨髓腔，推动活塞，冲洗骨髓至收集管中。
   11. 重复步骤 1.2.10，直至骨头呈现浅色且有光泽（即骨腔内明显无红褐色骨髓）。弃去空骨。
   12. 重复步骤 1.2.9 - 1.2.11，使用步骤 1.2.8 中获得的所有股骨和胫骨，并将所有回收的骨髓组织收集至步骤 1.2.10 中同一个 50 mL 收集管中。在处理完步骤 1.2.8 中所有骨骼之前，始终将收集管置于湿冰上保存。
   13. 通过轻柔吹打冲洗下来的碎骨髓组织，制备单细胞悬液。将骨髓单细胞悬液经置于新的50 mL收集管上的40 µm孔径滤网细胞筛过滤。
   14. 将含有骨髓单细胞悬液的50 mL收集管在450 x g条件下离心 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液。
   15. 将沉淀重悬于5 mL ACK裂解缓冲液（1 mM Na²EDTA；10 mM KHCO₃₃；144 mM NH₄⁺₄Cl；pH 7.2）以裂解红细胞。将细胞悬液在室温下孵育3分钟。随后立即向细胞悬液中加入10 mL PBS溶液。
   16. 将悬液在450 x g下离心 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于2 mL PBS溶液中。
   17. 使用血细胞计数板对骨髓细胞进行计数。保留一份6 x 10⁶个细胞的等分试样。⁶ 用于流式细胞术分析的细胞，以检测细胞纯化后细胞的纯度（参见步骤1.2.20）。
   18. 为去除骨髓单细胞悬液中的T细胞，使用 commercially available cell purification kit。根据生产商说明书，通过磁性分离法去除总骨髓细胞中的CD90.2+细胞（即淋巴细胞）。
   19. 使用血细胞计数板对按照步骤1.2.18所述方法分离的T细胞耗竭骨髓细胞进行计数。保留1 × 10⁶个细胞的等分试样，用于后续步骤1.2.20中所述的流式细胞术分析。
       注意： 单只供体小鼠平均获得的细胞产量通常为 2 x 107 至 3.4 x 107 个去除了T细胞的骨髓细胞。
   20. 通过流式细胞术确认T细胞去除成功。染色1 x 10⁶ 细胞，来自步骤1.2.17（磁性细胞分选前的骨髓细胞）和1.2.19（磁性细胞分选后的T细胞耗竭骨髓细胞），使用以下抗体进行染色：α-CD45.1（A20）、α-CD3（17A2）、α-CD4（GK1.5）和α-CD8α（53-6.7）。将步骤1.2.17中剩余的细胞用作未染色对照以及单染色对照，用于流式细胞仪的设置。
       1. 转移 1 x 10⁶ 将每个样本的细胞加入至96孔V型底板的一个孔中，以进行流式细胞术染色操作。
       2. 将96孔板中的细胞（步骤1.2.20.1）在450 x g条件下离心 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于100 µL FACS缓冲液（含3%过滤牛血清的PBS）中。
       3. 将96孔板中的细胞在450 x g下离心 g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液。
       4. 向每份样品中加入适量的所选抗体（与步骤 1.2.20 比较），溶于 100 µL FACS 缓冲液中，用于单染色。
       5. 配制所有抗体的混合液（主混合液），其中包含足够的量，用于分别染色之前（参见步骤1.2.17）和之后（参见步骤1.2.19）磁珠T细胞去除所保存的骨髓细胞等分试样。向两份等分试样中各加入100 µL主混合液。
       6. 仅向未染色样品中加入 100 µL FACS 缓冲液。
       7. 将细胞在4 °C避光孵育20分钟。
       8. 加入 100 µL FACS 缓冲液，于 96 孔板中以 450 x g 离心细胞 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于100 µL FACS缓冲液中。
       9. 以 450 x g 离心细胞 g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 250 µL FACS 缓冲液中。
       10. 将样品转移至5 mL聚苯乙烯圆底管中，并使用能够检测用于标记抗体的荧光分子的流式细胞仪分析样品（参见步骤1.2.20）。
       11. 比较磁性细胞分离前后细胞组成的变化。
           注意： 在活细胞门内，通常可获得约95%纯度的CD45.1+CD3-（即T细胞耗竭的骨髓）细胞。
   21. 用 PBS 溶液洗涤 T 细胞耗竭的骨髓细胞悬液 2 次（450 × g 在4 °C下离心5分钟，最后将细胞重悬于PBS溶液中，调整细胞浓度至5 × 10⁶⁷ 细胞/mL。注射前将细胞置于湿冰上保存。
   22. 将去除了T细胞的骨髓细胞注入前一日已接受照射的受体小鼠体内（参见第1.1节）。
       1. 将实验小鼠放入防漏的麻醉 chamber 中，通过吸入最高4%的异氟烷诱导麻醉，直至小鼠失去意识。通过检测翻正反射消失以及随后的足底回缩反射消失，确认镇痛效果和意识丧失。
       2. 注射 5 x 10⁶ 去T细胞的骨髓细胞（即 100 µL 的 5×10⁶⁷ 细胞/mL）的PBS溶液，使用配备30 G针头的1 mL注射器，静脉注射至含静脉窦的眶后腔。
3. 第2天：T细胞转移
   注意： 在无菌细胞培养操作台中进行下述操作，并使用过滤后的试剂。以CD45.2 C57Bl/6（野生型；WT）小鼠作为同种异体反应性T细胞的供体。使用同源标记系统可区分受体（CD45.2+ H2kd+ Balb/c小鼠）与供体造血细胞类型（骨髓细胞：CD45.1+ H2kb+ B6.SJL小鼠；同种异体T细胞：CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6小鼠）。
   1. 根据相关机构指南和主管部门要求，对C57Bl/6小鼠实施安乐死。通过吸入5%异氟烷对小鼠进行麻醉，持续暴露至呼吸停止后1分钟，并通过颈椎脱位法确认动物死亡。使用70%乙醇对小鼠皮毛和皮肤进行彻底消毒。
   2. 将带有40 µm孔径滤网的筛子置于50 mL收集管上。取出脾脏并放置在筛子上。
   3. 用注射器活塞在滤网上研磨脾脏组织。用 PBS 冲洗滤网和注射器活塞，以收集所有脾细胞。
   4. 将细胞在50 mL收集管中以450 x g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液。
   5. 将脾细胞重悬于 3 mL ACK 裂解缓冲液中以裂解红细胞。将细胞悬液孵育 3 分钟。随后，加入 10 mL PBS，于 450 x g 离心细胞 g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液，将脾细胞重悬于 PBS 中。
   6. 使用血细胞计数板对脾细胞进行计数。取一份 6 x 10⁶ 个细胞的等分试样。⁶ 用于流式细胞术分析的细胞，以评估步骤1.3.9中的纯化程度。
   7. 使用市售的细胞纯化试剂盒从总脾细胞中分离总CD3+ T细胞。按照生产商提供的说明书分离脾脏T细胞。
   8. 使用血细胞计数板对按照步骤1.3.7所述方法分离的脾脏CD3+ T细胞进行计数。保留1 x 10⁶个细胞的等分试样用于后续实验。⁶ 用于流式细胞术分析的T细胞
      注意： 每只供体小鼠通过磁性细胞分选法分离获得的脾脏T细胞平均产量为1.3 × 10⁷⁷ 至 2 × 10⁷ 细胞
   9. 通过流式细胞术确认T细胞分离的成功。有关染色方案的详细描述，请参考并遵循步骤1.2.20.1 - 1.2.20.10。
      1. 染色 1 × 10⁶ 步骤1.3.6（磁性细胞分选前）和步骤1.3.8（磁性细胞分选后）的脾细胞，使用以下抗体染色：α-CD45.2 (104)、α-CD3 (17A2)、α-CD4 (GK1.5) 和 α-CD8α (53-6.7)。
      2. 使用步骤1.3.6中剩余的细胞作为未染色对照以及分别用相应抗体进行单染，以调试流式细胞仪。
      3. 比较磁性细胞分离前后的细胞组成。
         注意： 在淋巴细胞活细胞门内，CD45.2+CD3+ T细胞的纯度应达到≥95%。
   10. 用 PBS 洗涤 T 细胞 2 次（450 × g 4 °C下离心5分钟，最后将细胞重悬于PBS溶液中，调整细胞浓度至7 x 10⁶ 细胞/mL。注射前将细胞置于冰上保存。
   11. 将同种反应性脾脏T细胞（见步骤1.3.10）注射入此前已接受CD45.1+ T细胞耗竭型骨髓细胞（见步骤1.2.22）的照射处理BALB/c小鼠体内。
       1. 将实验小鼠放入一个不漏气的麻醉舱中，通过接触最高达4%的异氟烷使其失去意识，以诱导麻醉。通过检测翻正反射的消失以及随后足底回缩反射的消失，确认镇痛效果和意识丧失。
       2. 注射 0.7 x 10⁶ 使用配备30 G针头的1 mL注射器分离同种反应性CD3+ T细胞  (即，加入100 µL浓度为7 × 10⁶ 细胞/mL）的PBS溶液（见步骤1.3.10），通过静脉注射至小鼠眶后腔，以诱导移植物抗宿主病（GvHD）。将这些小鼠命名为实验组。
       3. 向另一组小鼠经眼后静脉注射100 µL PBS，将该组定为对照组，后续称为“未移植T细胞小鼠”（no-T-cell-transplanted (noT) mice）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BIOBEAM 2000 γ射线辐照仪	Gamma-Service Meical GmbH
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken 镊子（长度：13 cm；带锯齿、弯曲尖端）	Fine Science Tools	11009-13
硬化精细剪刀（长度：8.5 cm；直头；刃长：24 mm）	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 培养基	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
皮下注射针头（26G）	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL 注射器	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL 离心管	Sarstedt Ag & Co.KG	6,25,47,254
带 40 µm 网筛的细胞滤器	BD Falcon	352340
带无菌内腔的胰岛素注射器（30G）	BD	324826
小鼠 Pan T 细胞分离试剂盒 II	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	用于磁珠细胞分选法分离脾脏 T 细胞
小鼠 CD90.2 MicroBeads	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	用于磁珠细胞分选法分离去 T 细胞的骨髓细胞
活检钳	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	结肠镜检查实验装置的组成部分
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Na2EDTA）	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ACK 裂解缓冲液的组分
Alexa Fluor 700 标记抗小鼠 CD45.2 抗体（克隆：104；批号：B252126；RRID: AB_493731）	Biolegend	109822
PE/Cy7 标记抗小鼠 CD45.1 抗体（克隆：A20；批号：B217246；RRID: AB_1134168）	Biolegend	110730
APC/Cy7 标记抗小鼠 CD8a 抗体（克隆：53-6.7；批号：B247008；RRID: AB_312753）	Biolegend	100714
Forane / 异氟烷	AbbVie Inc.	B506
过滤牛血清	Pan Biotec	P40-47500	FACS 缓冲液的组分