通过显微注射技术在肠道类器官中建立寄生虫感染的方法

摘要

来源：Dutta, D., 等 研究 隐孢子虫 通过显微注射在三维组织来源的人类类器官培养系统中建立感染 视频实验杂志 (2019).

本视频演示了一种显微注射技术，用于建立人肠道类器官感染模型。将寄生虫微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）的感染性子孢子阶段显微注射至类器官腔内。子孢子侵入类器官的上皮细胞后，通过无性和有性繁殖完成其生命周期，并扩散感染。

方案

1. 从C. parvum卵囊体外纯化子孢子

1. 按照上述方法漂白并洗去漂白剂后，从C. parvum卵囊中纯化子孢子。
   1. 将卵囊转移至15 mL离心管中。用室温脱囊培养基（含0.75% w/v 牛磺胆酸钠的DMEM）重悬卵囊，使卵囊浓度达到1 × 10⁷ 个/mL。添加牛磺胆酸钠可提高卵囊的脱囊率，从而增加子孢子的产量。
   2. 将卵囊悬液在37 °C孵育1–1.5小时。
   3. 在显微镜下检查样品的脱囊程度；60–80%的脱囊率可获得较好的子孢子回收效果。若脱囊率较低，可延长孵育时间（再孵育30分钟至1小时）。
   4. 根据起始卵囊数量计算脱囊百分比。脱囊率计算公式如下：
      % 脱囊率 = [1 – (完整卵囊数 / 起始卵囊数)] × 100
   5. 通过加入14 mL PBS或培养基混匀后，在3,400 × g条件下离心20分钟，洗涤细胞以去除脱囊试剂，从而收集细胞（包括完整卵囊、卵囊壳和子孢子）。吸弃上清时应小心操作，避免细胞损失。
   6. 将子孢子沉淀用1–2 mL DMEM重悬，使终浓度为3 × 10⁷ 个/mL（基于起始卵囊数量）。
   7. 为去除残留的卵囊和卵囊壳，将悬液通过3 µm滤膜过滤（图1B）。使用配备聚碳酸酯滤膜（孔径3 µm）的47 mm滤器装置，并连接10 mL注射器筒。将滤器装置置于15 mL离心管上方，并将整个装置放置于冰桶中或冷室中。
   8. 向滤器装置中加入7.5 mL子孢子悬液，依靠重力使其自然过滤。再用7.5 mL DMEM冲洗滤膜。
      注意：为确保子孢子分离成功，新鲜卵囊和良好的脱囊效果至关重要。若未脱囊的卵囊过多，悬液将无法依靠重力顺利过滤。对注射器施加压力可能导致未脱囊卵囊被强行挤过滤膜。与卵囊相比，子孢子显微注射更具挑战性，因为子孢子容易聚集并堵塞毛细管。为避免此问题，建议在向类器官注射子孢子时使用更宽口径的毛细管尖端。为达到足够的感染水平，每个类器官所需注射的子孢子数量应为感染卵囊时的2–4倍。
   9. 将过滤后的子孢子悬液在3,400 × g条件下使用水平转子离心20分钟，沉淀子孢子。
   10. 用50–100 μL OME或OMD类器官培养基（参见材料表）重悬沉淀，培养基中需添加0.05% (w/v) 快绿染料以及含L-谷胱甘肽、甜菜碱、L-半胱氨酸、亚油酸和牛磺酸的还原缓冲液（参见材料表）。
       注意：卵囊孵育时间过长可能导致子孢子裂解，降低回收率，因此应避免。

2. 用于显微注射的人类肠道类器官体外培养

1. 在扩增和分化培养基条件下培养肠道类器官。
   注意：肠道类器官的传代细节此前已在其他文章中描述（参见材料表中的培养基配方）。此处我们简要描述类器官培养方法，并特别针对Cryptosporidium的显微注射与生长进行优化。我们发现，在类器官中成像寄生虫时，使用扩增培养基培养的类器官优于使用分化培养基培养的类器官，因为前者积累的碎片较少。然而，如果目标是分离卵囊，则在分化培养基中培养的类器官可产生更多的卵囊。
   1. 将类器官在37 °C的细胞外基质（参见材料表）中以三维形式培养。在顶部加入OMO（类器官扩增培养基），并每天更换。
   2. 为进行显微注射而传代和铺板类器官时，从含有人类类器官的6孔板中移除培养基，向孔中加入F12+++（参见材料表），用1 mL移液枪头反复吹打数次以打碎基质。将细胞收集至15 mL离心管中（每管2 mL F12+++足以进行后续操作）。
   3. 向另一15 mL离心管中加入10–12 mL F12+++，将一支火焰抛光的玻璃移液管插入液体中，上下吹打3次以打碎人类肠道类器官。
      注意：使用长玻璃移液管（20–30 cm），并短暂进行火焰抛光。切勿将开口（直径1 mm）做得过小，以免损伤类器官。通过短暂火焰抛光使移液管末端光滑。将类器官打碎成约50 µm的小片段。
   4. 加入F12+++至总体积5–7 mL，以350 x g离心5分钟。
      注意：此步骤的离心速度高于常规，目的是形成良好的细胞沉淀，使其与细胞外基质充分分离（参见材料表）。我们观察到，与小鼠小肠类器官相比，人类小肠类器官更难解离。
   5. 尽可能移除上清液而不扰动细胞沉淀，然后用保持在4 °C的基质重悬沉淀；每六孔板孔需加入200–300 µL基质。类器官应按1:3比例传代，以维持较高的细胞密度。
   6. 将类器官以每滴约5–10 µL的基质滴加至六孔板孔中进行铺板。在37 °C孵育20–30分钟后，在顶部加入扩增培养基（OMO）。
   7. 每2–3天更换一次培养基。
      注意：在扩增培养基中培养约5–7天后，类器官可生长至100–200 μm，此时可用于注射。
   8. 为诱导类器官分化，在扩增培养基中培养5–6天后，更换为分化培养基（DM）条件，并继续培养额外5–6天后再接种寄生虫。
      注意：为扩增类器官，建议高密度铺板。为进行显微注射，推荐使用六孔板，并以较低密度铺板。例如，将三个六孔板孔中的类器官接种至一个完整的六孔板中用于显微注射。基质应于-20 °C长期保存，使用前在4 °C或冰上解冻。

3. 将卵囊/子孢子显微注射至类器官腔内

1. 将寄生虫显微注射至三维类器官的顶端侧（图2）。
   1. 使用微量移液器拉制仪制备直径为1 mm的玻璃毛细管。
      注意：微量移液器拉制仪（见材料表）的设置参数为：加热值 = 663，拉力 = 100，速度 = 200，时间 = 40 ms。具体设置需根据所用仪器的用户说明书进行调整。
   2. 用镊子剪断毛细管尖端，使毛细管末端的尺寸/直径约为9–12 μm，以便卵囊（大小为4–5 μm）顺利通过。
   3. 使用微量加样吸头将卵囊或子孢子悬液吸入毛细管中。
   4. 将含有卵囊的毛细管装载到显微注射仪上。
   5. 在倒置显微镜下（5倍放大），向每个类器官显微注射100–200 nL悬液，并保持压力恒定。显微注射后，每天更换OMO或OMD（类器官分化培养基），并将培养板维持在37 °C。
      注意：本实验未使用显微操作器进行显微注射。建议整个实验过程中使用同一根毛细管，以确保每个样本的注射量一致。

结果

图1：Cryptosporidium 卵囊和子孢子的制备与纯化。（A）用于感染实验的卵囊和子孢子制备方法的示意图。（B）卵囊体外脱囊过程的图像。通过过滤未脱囊的卵囊和囊壳，获得纯化的子孢子溶液。比例尺 = 10 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基底膜提取物（细胞外基质）	amsbio	3533-010-02
Dynamag 15 磁力架	Thermofisher Scientific	12301D
Dynamag 2 磁力架	Thermofisher Scientific	12321D
EMD Millipore Isopore 聚碳酸酯膜滤器 - 3µm	EMD-Millipore	TSTP02500
快绿染料	SIGMA	F7252-5G
Femtojet 4i 显微注射仪	Eppendorf	5252000013
直径为 1 mm 的玻璃毛细管	WPI	TW100F-4
Matrigel（细胞外基质）	Corning	356237
1.5 ml 微量离心管	Eppendorf	T9661-1000EA
微量加样器吸头（Micro-loader tips）	Eppendorf	612-7933
显微玻璃毛细管拉制仪 P-97	Shutter instrument	P-97
青霉素-链霉素溶液（Penstrep）	Gibco	15140-122
次氯酸钠（使用浓度为 5%）	Clorox	50371478
Super stick 载玻片	Waterborne, Inc	S100-3
Swinnex-25 47 mm 聚碳酸酯滤膜支架	EMD-Millipore	SX0002500
牛磺胆酸钠盐水合物	SIGMA	T4009-5G
Tween-20	Merck	8221840500
Vortex Genie 2 涡旋振荡器	Scientific industries, Inc	SI0236
Adv+++（DMEM + Penstrep + Glutamax + Hepes）			终体积
DMEM	Invitrogen	12634-010	500 ml
Penstrep	Gibco	15140-122	在 500 ml DMEM 中加入 5 ml 储存液
Glutamax	Gibco	35050038	在 500 ml DMEM 中加入 5 ml 储存液
Hepes	Gibco	15630056	在 500 ml DMEM 中加入 5 ml 储存液
肠道类器官培养基-OME（扩增培养基）			终浓度
A83-01	Tocris	2939-50mg	0.5 µM
Adv+++			加至 100 ml
B27	Invitrogen	17504044	1X
EGF	Peprotech	AF-100-15	50 ng/mL
胃泌素（Gastrin）	Tocris	3006-1mg	10 nM
NAC	Sigma	A9125-25G	1.25 mM
NIC	Sigma	N0636-100G	10 mM
Noggin CM	本实验室制备*		10%
p38 抑制剂（SB202190）	Sigma	S7076-25 mg	10 µM
PGE2	Tocris	2296-10	10 nM
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	每 500 ml 培养基加入 1 ml
RSpoI CM	本实验室制备*		20%
Wnt3a CM	本实验室制备*		50%
本实验室制备* — 细胞系可根据请求提供
肠道类器官培养基-OMD（分化培养基）			为诱导类器官分化，将扩增中的小肠类器官在富含 Wnt 的培养基中培养 6 至 7 天，随后转入分化培养基（从富含 Wnt 的培养基或 OME 中去除 Wnt、烟酰胺、SB202190 和前列腺素 E2）
还原缓冲液（用于重悬卵囊和子孢子以进行注射）			终浓度
还原型 L-谷胱甘肽	Sigma	G4251-10MG	0.5 μg/μl OME/OMD/LOM
甜菜碱（Betaine）	Sigma	61962	0.5 μg/μl OME/OMD/LOM
L-半胱氨酸（L-Cysteine）	Sigma	168149-2.5G	0.5 μg/μl OME/OMD/LOM
亚油酸（Linoleic acid）	Sigma	L1376-10MG	6.8 μg/ml OME/OMD/LOM
牛磺酸（Taurine）	Sigma	T0625-10MG	0.5 μg/μl OME/OMD/LOM