人支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞外陷阱的可视化

摘要

来源：Sharma, R. 等，利用共聚焦显微镜观察巨噬细胞胞外陷阱，J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了如何对支气管肺泡灌洗液中支气管肺泡巨噬细胞的巨噬细胞胞外诱捕网（METs）进行免疫标记，并利用共聚焦显微镜对其进行可视化观察。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 支气管肺泡灌洗（BAL）巨噬细胞

1. 通过（1）支气管镜检查法从人体受试者获取支气管肺泡灌洗液，以及（2）采用经气管抽吸法从小鼠获取支气管肺泡灌洗液，以获得肺泡巨噬细胞。
   注意： 获取巨噬细胞通常会导致这些细胞发生一定程度的活化。巨噬细胞来源于因疑似医学问题而需接受支气管镜检查的患者，并非所有受试者均适用于巨噬细胞胞外诱捕网（METs）的分析（具体适用性需根据各个独立研究项目确定）。
   1. 取 BAL 溶液并离心（500 x g 离心10分钟形成沉淀，用培养基（含5%胎牛血清和1% L-谷氨酰胺的RPMI培养基）在室温下洗涤两次，然后将细胞重悬于4 mL培养基中。
   2. 如有必要，可申请正式的分类计数；大多数细胞（通常 >80%）将为巨噬细胞。
      注意： 这通常由临床组织学服务机构根据不同类型细胞的形态学特征来完成。
   3. 使用台盼蓝排斥法和血细胞计数板对支气管肺泡灌洗液进行可存活巨噬细胞计数。
      注意： 按照步骤1.1所述，从人类和小鼠获取BAL液。
   4. 加入 1 - 4 x 10⁵ 将巨噬细胞接种于含盖玻片的24孔板中，每孔加入500 µL培养基，37°C过夜培养；细胞将贴附于盖玻片上。对于人源样本，需添加抗生素（例如，青霉素和链霉素，10⁴ U/mL）以防止细菌污染。

2. 支气管肺泡灌洗液巨噬细胞的免疫荧光标记/显微镜检测

注意： 细胞已如上所述贴附于盖玻片上。

1. 移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。用含2%多聚甲醛/高碘酸盐/赖氨酸（PLP）的固定液固定细胞10分钟。
2. 用PBS短暂洗涤细胞，然后在含0.2% Tween 20的PBS中透化处理20分钟。
3. 用含10%鸡血清和5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液封闭细胞，室温孵育30分钟。
4. 加入一抗和同型对照抗体，室温下以1:100的浓度孵育1小时（更详细的说明见材料表），或在37 °C进行孵育。
   注意：对于支气管肺泡灌洗（BAL）样本，通常无需使用巨噬细胞的特异性标记物。
5. 加入一抗后，用PBS洗涤细胞，再与相应的二抗在室温下孵育40分钟。
6. 用PBS洗涤样本，然后使用含DAPI的封片剂封片，通过共聚焦显微镜（如上所述）在405、488、561和647 nm激光激发下，使用40倍、1.0 NA油镜进行观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人源样本：一抗
兔抗人 H3Cit（瓜氨酸 R26）	Abcam	AB5103	10 µg/mL
小鼠抗人 MMP9	Novus Biological	AB119906	1:200 腹水，未提供浓度
兔抗人 PADI2/PAD2	Abcam	AB16478	7 µg/mL
小鼠抗人 PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 µg/mL
二抗
鸡抗兔 AF 488	Life technologies	A-21441
鸡抗兔 AF 594	Life technologies	A-21442
鸡抗山羊 AF 594	Life technologies	A-21468
鸡抗小鼠 AF488	Life technologies	A-21200
软件程序
Imaris	Bitplane
Image J	NIH
荧光强度平均值可通过 Microsoft Excel 等标准办公软件进行计算
显微镜
C1 共聚焦扫描显微镜	Nikon
FV1200 共聚焦扫描显微镜	Olympus
来自莫纳什医疗中心支气管镜检查室的人类支气管肺泡灌洗（BAL）样本
培养基
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F0926
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513
其他试剂
多聚甲醛/高碘酸/赖氨酸（PLP）固定液	Sigma-Aldrich	27387
天然甲醛	Sigma-Aldrich	42904
盖玻片 12 mm	Sigma-Aldrich	S1815
盖玻片 60 × 24 mm	Sigma-Aldrich	C6875