人支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞细胞外陷阱的可视化

摘要

来源:Sharma， R. et al.， 使用共聚焦显微镜可视化巨噬细胞细胞外陷阱。J. Vis. Exp. （2017 年）

该视频演示了支气管肺泡灌洗液中支气管肺泡巨噬细胞中巨噬细胞细胞外陷阱 MET 的免疫标记，以及使用共聚焦显微镜对其进行可视化。

方案

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 支气管肺泡灌洗液 （BAL） 巨噬细胞

1. 使用 BAL 通过 （1） 支气管镜检查获得人类受试者的肺巨噬细胞，以及 （2） 通过使用气管内抽吸获得 （2） 小鼠><的肺巨噬细胞。 注意:巨噬细胞的获得通常会导致这些细胞的一些激活。巨噬细胞是从需要支气管镜检查以调查潜在医疗问题的患者那里获得的，并非所有受试者都适合分析巨噬细胞细胞外陷阱或 MET（这需要为每个单独的项目确定）。
   1. 取 BAL 溶液并向下旋转（500 x g 10 分钟）形成沉淀，在室温下用培养基（含 5% 胎牛血清和 1% L-谷氨酰胺的罗斯威尔公园纪念研究所培养基 （RPMI））洗涤两次，然后在 4 mL 培养基中稀释细胞。
   2. 如有必要，要求进行正式的分类计数;大多数细胞（通常为 >80%）将是巨噬细胞。
      注意:这通常由临床组织学服务使用不同细胞类型的形态学外观进行。
   3. 使用台盼蓝排除法和血细胞计数器在 BAL 溶液上进行活的巨噬细胞计数。
      注意:如步骤 1.1 中所述，从人和小鼠获得 BAL 溶液。
   4. 将 1 - 4 x 10⁵ 个巨噬细胞添加到盖玻片上的 24 孔板中，每孔加入 500 μL 培养基中，并在 37°C 下放置过夜;细胞将粘附在盖玻片上。对于人类样品，添加抗生素（例如青霉素和链霉素，10⁴ U/mL）以防止细菌污染。

2. BAL 巨噬细胞的免疫荧光标记/显微镜检查

注意:如上所述，细胞粘附在盖玻片上。

1. 去除培养基并用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞一次。将细胞固定在 2% 多聚甲醛/高碘酸盐/赖氨酸 （PLP） 固定剂中 10 分钟。
2. 在 PBS 中短暂洗涤细胞，然后在 PBS 中的 0.2% 吐温 20 中透化 20 分钟。
3. 用 10% 鸡血清在 5% 牛血清白蛋白 （BSA） 中用 PBS 稀释 30 分钟封闭细胞。
4. 在室温下以 1:100 的浓度（更具体的详细信息列于材料表中）在 37 °C 下与一抗和同种型对照抗体孵育 1 小时><。 注意:对于 BAL 样品，通常不需要巨噬细胞的特异性标志物。
5. 加入一抗后，在 PBS 中洗涤细胞，并在室温下与相应的二抗进一步孵育 40 分钟。
6. 在 PBS 中清洗切片，并使用基于 DAPI 的安装介质进行安装，以便在激光激发 405、488、561 和 647 nm 下使用共聚焦显微镜（如上所述）和 40X、1.0 NA 油物镜进行可视化。

材料