一种通过喷雾接种法在水稻叶片上建立真菌感染的技术

摘要

来源：Zhang, M., 等. 植物感染试验：喷雾与伤口介导接种植物病原菌Magnaporthe Grisea。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种在水稻叶片上建立稻瘟病菌Magnaporthe grisea感染的技术。将真菌分生孢子悬浮液喷洒至水稻叶片区域，通过评估坏死病斑的形成情况来判断病害发展程度。

方案

1. 使用稻瘟病菌（M. grisea）分生孢子悬浮液进行喷雾接种

1. 稻瘟病菌（M. grisea）的真菌培养
   1. 制备燕麦番茄琼脂（OTA）培养基用于真菌菌株培养。
   2. 称取30–50 g燕麦片，加入800 mL去离子水（ddH₂O），在电热锅中煮沸30分钟。
   3. 用纱布过滤煮沸后的燕麦汁至烧杯中。
   4. 向烧杯中的滤液加入150 mL番茄汁和20 g琼脂，并用ddH₂O定容至1,000 mL。
2. 实验材料的准备
   1. 将约50粒水稻（Oryza sativa）品种丽江新团黑谷（LTH）种子在ddH₂O中浸泡3天，或约50粒大麦（Hordeum vulgare cv Golden Promise）种子在ddH₂O中浸泡约1天。
   2. 将水稻或大麦种子用湿润纱布包裹，置于约30个直径为10 cm × 10 cm的培养皿中的湿润滤纸上，在28 °C条件下萌发。水稻种子萌发时间约为2–3天，大麦种子萌发时间约为2天。温室相对湿度约为70%。
   3. 将水稻或大麦幼苗种植于经高压灭菌的盆栽土中，浇水后覆盖一层蛭石。
   4. 将植株置于25 °C的适宜玻璃温室或生长箱中培养约1～2周。
   5. 用无菌手术剪将三层滤纸剪成圆形（每个圆直径应为8 cm），并放置于100 mm无菌塑料培养皿中。
   6. 向每个培养皿中加入ddH₂O，浸湿滤纸。
   7. 确保滤纸完全湿润，但不要添加过量水分。
   8. 用真空泵吸除多余水分。
   9. 在培养皿中放入两根无菌牙签，用于支撑水稻/大麦叶片；牙签间距约为2–3 cm。
   10. 在播种后2周采集水稻叶片，或在播种后7天采集大麦叶片。
   11. 取4至6叶期的水稻/大麦幼苗，从顶部向下约5 cm处剪去茎的下部，并收集叶片。
3. 喷雾接种程序
   1. 将真菌菌株在OTA平板上置于恒温培养箱（25 °C）中培养约4天。
   2. 使用0.5–5 mL移液器向每个培养4天的平板中加入约2 mL ddH₂O。
   3. 用接种环将M. grisea野生型菌株和突变菌株的菌丝刮入菌丝碎片中。
   4. 收集菌丝碎片并转移至新的OTA平板。将菌丝碎片在洁净工作台中吹干。
   5. 用三层纱布覆盖平板，并在白天25 °C（14小时）、夜间23 °C（10小时）的温室中培养24–48小时，以保证分生孢子生长所需的湿度。
   6. 向每个平板中加入2 mL ddH₂O，用无菌棉签轻轻刮取分生孢子，随后通过两层镜头纸过滤。注意不要刮伤培养基表面。
   7. 使用100–1,000 µL移液器将分生孢子悬液转移至新的50 mL离心管中。
   8. 在25 °C下以至少5,000 × g离心5分钟。
   9. 弃去上清液，将沉淀重悬于0.025%（v/v）Tween-20溶液中，使孢子浓度为每毫升2 × 10⁴个分生孢子。Tween-20溶液体积通常为10–20 mL。
   10. 将孢子悬液倒入手持式喷雾器中。
   11. 向2周龄水稻幼苗的叶片或7日龄大麦幼苗的叶片喷洒约10 mL分生孢子悬液，并在25 °C黑暗高湿环境中孵育约24小时。对照植株喷施0.025%（v/v）Tween-20溶液。
   12. 将叶片转移至另一光照湿润培养箱中，在25 °C下进行12小时光照周期培养。
   13. 接种后5天记录病害症状。检查长约6 cm的发病水稻/大麦叶片。抗病性评价标准依据国际水稻研究所（IRRI）的稻瘟病抗性评分系统。表1中列出了该抗性评分系统的详细内容。
   14. 拍摄叶片照片以评估测试菌株的侵染情况。侵染程度通过每3.6 cm²面积上的病斑数量进行评估。

表1：稻瘟病抗性评分系统。 本表格引自国际水稻研究所（IRRI）。

等级	描述
1	针尖大小的小型褐色斑点
2	小型近圆形至略呈椭圆形的坏死性灰斑，直径约1-2 mm，具有明显的褐色边缘。病斑主要出现在上部叶片
3	病斑类型与等级2相同，但上部叶片上的病斑数量显著增多
4	典型的感病型稻瘟病病斑，长度达3 mm或以上，侵染面积小于叶片面积的4%
5	典型的感病型稻瘟病病斑，长度达3 mm或以上，侵染面积占叶片面积的4-10%
6	典型的感病型稻瘟病病斑，长度达3 mm或以上，侵染面积占叶片面积的11-25%
7	典型的感病型稻瘟病病斑，长度达3 mm或以上，侵染面积占叶片面积的26-50%
8	典型的感病型稻瘟病病斑，长度达3 mm或以上，侵染面积占叶片面积的51-75%，多数叶片已死亡
9	典型的感病型稻瘟病病斑，长度达3 mm或以上，侵染面积超过叶片面积的75%

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	AOBOX Biotechnology (中国)	01-023
滤纸	GE Healthcare 品牌 (瑞典)	10311387
50 mL 离心管	CORNING (美国)	430290
离心机	Eppendorf (美国)	5804R
Tween-20	Coolaber (中国)	CT11551-100ml
培养皿	Thermofisher (美国)	150326
0.5–5 mL 移液器	Eppendorf	4920000105
100–1000 µL 移液器	Eppendorf	4920000083
真空泵	Leybold	D25B
培养箱	MEMMERT	PYX313
接种环	Greiner Bio One	731175