通过创伤接种真菌建立水稻植株叶片感染

摘要

来源：Zhang, M. 等，植物感染试验：喷雾与伤口介导的植物病原菌 Magnaporthe grisea接种方法 J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了通过伤口接种Magnaporthe grisea菌丝体建立水稻植株叶片感染的方法。真菌孢子萌发形成的芽管穿透表皮层，导致叶片组织感染并形成病斑。该方法有助于致病型筛选，并加深对植物抗性机制的理解，从而促进分子育种研究。

方案

1. 真菌培养用于 M. grisea

1. 制备真菌菌株用的燕麦番茄琼脂（OTA）培养基。
2. 称取30–50 g燕麦片，加入800 mL蒸馏水/去离子水（ddH₂O），在电热锅中煮沸混合物30分钟。
3. 通过纱布将煮沸的燕麦汁过滤至烧杯中。
4. 向烧杯中的滤液中加入150 mL番茄汁和20 g琼脂，并加入ddH₂O₂O 至 1,000 mL。

2. 实验材料的准备

1. 将约50粒水稻种子浸泡Oryza sativa品种丽江新团黑谷（LTH）在ddH₂O中₂O 处理 3 天或浸泡约 50 粒大麦种子（大麦 cv Golden Promise）在 ddH₂O 中₂约1天。
2. 将水稻或大麦种子用湿润纱布包裹，置于约30个直径为10 cm × 10 cm的培养皿中的湿润滤纸上，在28 °C条件下萌发。水稻种子萌发时间约为2–3 d，大麦种子萌发时间约为2 d。温室相对湿度约为70%。
3. 将水稻或大麦幼苗种植于花盆中，使用经高压灭菌的盆栽土并浇水，然后覆盖一层蛭石。
4. 将植物置于适宜的玻璃温室或人工气候箱中，在25 °C下培养约1~2周。
5. 用无菌手术剪刀将三层滤纸剪成直径为8 cm的圆形，放置于100 mm的无菌塑料培养皿中。
6. 加入ddH₂O₂向每皿中加入 O 以浸润滤纸。
7. 确保滤纸完全润湿，但不要添加多余的水。
8. 使用真空泵去除多余的水分。
9. 将两根无菌牙签放入培养皿中，用于支撑水稻/大麦叶片；牙签间距约为 2 - 3 cm。
10. 播种后两周采集水稻叶片，或在播种后七天采集大麦叶片。
11. 使用具有4至6片叶的水稻/大麦幼苗，从顶部约5 cm处剪断茎的下部，并收集叶片。

3. 使用 M. grisea菌丝块或分生孢子悬浮液滴进行创伤接种

1. 使用解剖针在离体水稻/大麦叶片的主脉上刮出三道长2 - 3 cm的伤口；注意不要穿透叶片。
2. 将刮伤的叶片插在牙签上，并喷洒0.02% (v/v) Tween-20溶液，使叶片表面形成一层液滴。
3. 从OTA平板上为每种 M. grisea 菌株（野生型、突变体、互补菌株或其他测试菌株）切取一块0.5 cm × 0.5 cm的菌丝块。
4. 将菌丝块或25 µL分生孢子悬浮液滴加到受伤的叶片上，置于湿润培养箱中，25 °C下培养3 - 8天。
5. 在接种后5 - 7天观察病斑情况。检测方法与喷雾接种法相同（见步骤1.3.13）。
6. 观察长约6 cm的感病水稻/大麦叶片，并拍照以评估测试菌株的侵染能力。通过每3.6 cm²面积上的病斑数量来评估侵染程度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	AOBOX Biotechnology (中国)	01-023
滤纸	GE Healthcare 品牌 (瑞典)	10311387
Tween-20	Coolaber (中国)	CT11551-100ml
培养皿	Thermofisher (美国)	150326
真空泵	Leybold	D25B
解剖针	FST	26000-35
培养箱	MEMMERT	PYX313