一种用于检测病毒感染的体外重组病毒报告系统

摘要

来源：Nishitsuji, H., 等. 乙型肝炎病毒报告系统的开发以监测复制周期的早期阶段. J. Vis. Exp. (2017).

本视频演示了一种 体外 检测乙型肝炎病毒（HBV）感染的技术 通过 一种重组HBV报告系统。感染宿主细胞后，重组病毒基因组表达荧光素酶报告蛋白，该酶在氧化其底物时产生生物发光，从而有助于检测病毒感染。

方案

1. 编码报告蛋白的重组乙型肝炎病毒的制备

1. HepG2 细胞的准备
   1. 准备细胞培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基，即 DMEM），添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 100 U/ml 非必需氨基酸。
   2. 转染前一天，将 4 × 10⁶ 个 HepG2 细胞接种于含 10 ml 培养基的 10 cm 胶原蛋白包被培养皿中。将 HepG2 细胞在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育。
      注意：当在 10 cm 胶原蛋白包被培养皿中接种约 4 × 10⁶ 个 HepG2 细胞并加入 10 ml 培养基时，次日细胞融合度可达 70–90%。
2. 转染
   1. 使用转染试剂，按照制造商说明书，将 5 µg pUC1.2HBV（乙型肝炎病毒）delta epsilon 和 5 µg pUC1.2HBV/NL15 共同转染至 HepG2 细胞中。
   2. 次日，移除培养基，并加入 10 ml 新鲜培养基。
   3. 转染一周后，将含有重组 HBV 的培养基转移至 50 ml 离心管中，并进行步骤 1.3.1。向转染细胞所在的培养皿中加入 10 ml 新鲜培养基。
      注意：重组 HBV 的产生可持续维持 4 周。含有重组 HBV 的培养基可在 4 °C 下保存 1 个月。
3. 重组 HBV 的纯化
   1. 通过离心（2,300 × g，4 °C，5 分钟）去除含重组 HBV 的培养基中的细胞碎片。
   2. 将上清液通过 0.45 µm 膜滤器过滤。
   3. 向含重组 HBV 的培养基中加入等体积的 26% PEG/1.5 M NaCl（聚乙二醇 6000：130 g，NaCl：49 g，0.5 M EDTA（乙二胺四乙酸）1 ml（pH 8.0），1 M HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）5 ml（pH 7.6），加水至 500 ml），轻轻混匀。4 °C 过夜孵育。
   4. 在 4 °C 下以 2,300 × g 离心 20 分钟。
   5. 弃去上清液，将沉淀溶解于 0.5 ml TNE 缓冲液（10 mM Tris（三(羟甲基)氨基甲烷)，50 mM NaCl，1 mM EDTA）中。
   6. 以 2,300 × g 离心 5 分钟，去除残留碎片。
   7. 将含重组 HBV 的 0.5 ml TNE 溶液加至 0.8 ml 20% 蔗糖（溶于 TNE）上层。
   8. 在 15 °C 下以 100,000 × g 超速离心 3 小时。
   9. 尽可能弃去上清液，保留沉淀。每 40 ml 初始培养基所得样品，用 1 ml 无血清 DMEM 重悬沉淀。
   10. 4 °C 过夜孵育。
   11. 通过 0.45 µm 滤器过滤。分装为 0.5 ml 每份，于 -80 °C 保存。
       注意：若原始病毒样品中存在报告蛋白污染，可通过在 TNE 中进行 5–30% 蔗糖密度梯度超速离心（100,000 × g，2 小时）或 CsCl 密度平衡离心（密度 1.1–1.6 g/ml，150,000 × g，50 小时）进一步纯化病毒。

2. 重组HBV的感染

1. 在含有10% FBS、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、250 µg/ml G-418（遗传霉素）和100 U/ml 非必需氨基酸的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂ 恒湿培养箱中培养对HBV感染敏感的稳定表达NTCP（钠-牛磺胆酸共转运多肽）的HepG2细胞（HepG2/NTCP）。
2. 感染前一天，将约5 × 10⁴ 个HepG2/NTCP细胞以0.1 ml培养基接种至96孔胶原包被板中。
3. 将重组HBV在37 °C水浴中解冻，直至管中尚存少量冰晶为止。
4. 按每96孔板孔量配制感染用培养基：将10 µl 40% PEG8000溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入2 µl 二甲基亚砜（DMSO）、10 µl 重组HBV和78 µl 新鲜培养基，混匀。
5. 向96孔板的某一孔中加入100 µl 重组HBV溶液。
6. 感染后一天，用每孔300 µl PBS洗涤感染细胞3次，以去除病毒组分中污染的报告蛋白。
7. 将感染后的细胞在含有2% DMSO的200 µl 培养基中孵育一周或更短时间。

3. 分析

1. 感染后一周，用 PBS 清洗感染的细胞 3 次。
2. 向感染的细胞中加入 50 µl 裂解缓冲液。
3. 将培养板轻轻摇动 5 分钟，然后在 2,000 × g 下离心 5 分钟。
4. 向发光检测仪板中加入 50 µl 报告分子底物。
5. 将 20 µl 细胞裂解液加入含有报告分子底物的发光检测仪板中，短暂涡旋混匀。
6. 将板放入发光检测仪中并开始读数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nano-Glo 荧光素酶检测试剂	Promega	N1110
青霉素-链霉素混合溶液	Nacalai Tesque	09367-34
MEM 非必需氨基酸溶液	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I 低血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/胶原蛋白包被培养皿	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	L3000001
聚乙二醇 (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
聚乙二醇 (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai Tesque	31319-45
0.5 mol/L EDTA 溶液	Nacalai Tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai Tesque	35434-21
Millex-HP，0.45 μm，聚醚砜滤膜	Merck Millipore	SLHP033RS
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
胶原蛋白包被 96 孔板	Corning	NO3585
5× 被动裂解缓冲液	Promega	E1941
GloMax 96 微孔板发光仪	Promega	E6501
蔗糖	Nacalai Tesque	30403-55
发光仪专用检测板	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
pUC1.2HBV/NL	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
50 ml 离心管	Violamo	1-3500-02
抗 Myc 抗体	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	日本血液制品机构	-
IFN-β	Mochida 制药	1.49872E+13
肝素	Sigma-Aldrich	H3393