一种用于检测病毒感染的体外重组病毒报告系统

摘要

来源：Nishitsuji, H., 等. 乙型肝炎病毒报告系统的开发以监测复制周期的早期阶段. J. Vis. Exp. (2017).

本视频演示了一种 体外 检测乙型肝炎病毒（HBV）感染的技术 通过 一种重组HBV报告系统。感染宿主细胞后，重组病毒基因组表达荧光素酶报告蛋白，该酶在氧化其底物时产生生物发光，从而有助于检测病毒感染。

方案

1. 编码报告蛋白的重组乙型肝炎病毒的制备

1. HepG2 细胞的准备
   1. 准备细胞培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基，即 DMEM），添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 100 U/ml 非必需氨基酸。
   2. 转染前一天，将 4 × 10⁶ 个 HepG2 细胞接种于含 10 ml 培养基的 10 cm 胶原蛋白包被培养皿中。将 HepG2 细胞在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育。
      注意：当在 10 cm 胶原蛋白包被培养皿中接种约 4 × 10⁶ 个 HepG2 细胞并加入 10 ml 培养基时，次日细胞融合度可达 70–90%。
2. 转染
   1. 使用转染试剂，按照制造商说明书，将 5 µg pUC1.2HBV（乙型肝炎病毒）delta epsilon 和 5 µg pUC1.2HBV/NL15 共同转染至 HepG2 细胞中。
   2. 次日，移除培养基，并加入 10 ml 新鲜培养基。
   3. 转染一周后，将含有重组 HBV 的培养基转移至 50 ml 离心管中，并进行步骤 1.3....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nano-Glo 荧光素酶检测试剂	Promega	N1110
青霉素-链霉素混合溶液	Nacalai Tesque	09367-34
MEM 非必需氨基酸溶液	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I 低血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/胶原蛋白包被培养皿	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	L3000001
聚乙二醇 (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
聚乙二醇 (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai Tesque	31319-45
0.5 mol/L EDTA 溶液	Nacalai Tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai Tesque	35434-21
Millex-HP，0.45 μm，聚醚砜滤膜	Merck Millipore	SLHP033RS
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
胶原蛋白包被 96 孔板	Corning	NO3585
5× 被动裂解缓冲液	Promega	E1941
GloMax 96 微孔板发光仪	Promega	E6501
蔗糖	Nacalai Tesque	30403-55
发光仪专用检测板	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
pUC1.2HBV/NL	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
50 ml 离心管	Violamo	1-3500-02
抗 Myc 抗体	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	日本血液制品机构	-
IFN-β	Mochida 制药	1.49872E+13
肝素	Sigma-Aldrich	H3393