成年斑马鱼口服插管给药实验方法

摘要

本视频展示了一种对成年斑马鱼进行经口插管的技术，用于将实验性化合物递送至食管，并监测其在肠道内的吸收情况。该方法为研究口服预防药物或其他化合物在肠道内的动态过程提供了一个有价值的模型。

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核

1. 所需溶液

使用饲养斑马鱼的水族箱水配制 150 mg/L（用于麻醉）或 300 mg/L（用于安乐死）的氨基甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222）溶液。取 1 L 麻醉液注入小容器中，并持续供气。
另取一小型容器，加入 1 L 不含 MS-222 的水族箱水用于鱼类复苏，并持续供气。
用 10x 无菌储备液配制 50 mL 的 1x PBS 缓冲液。
为进行流式细胞分析或肠道细胞分离，使用胶原酶 IV 型粉末或储备液，在含 1% v/v 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中新鲜配制足够量的 0.15% 胶原酶 IV 型溶液（每条鱼 1 mL）。将溶液分装至 2 mL 离心管中（每管 1 mL，对应一条鱼）。在解剖前 30 分钟取出，此前保持 4 °C 保存。
为共聚焦显微镜观察或样本固定，于通风橱内用 PBS 新鲜配制 50 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，或从 -20 °C 冰箱中取出储备液在通风橱内解冻。
注意：PFA 具有毒性。操作前请仔细阅读材料安全数据表。操作时应佩戴手套和护目镜，所有溶液操作均须在通风橱内进行。

2. 准备经口插管设备

3. 荧光纳米颗粒悬浮液的制备

根据制造商说明书，使用 Atto-488 NHS 酯（参见材料表）或适当的荧光染料标记蛋白质纳米颗粒。
将纳米颗粒重悬于 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液中，浓度为 2 mg/mL。
将 Atto 488 NHS 酯溶解于无胺的二甲基亚砜（DMSO）中，浓度为 2 mg/mL。保留 10 µL 分装样品以检测标记效率。
将纳米颗粒与 Atto 488 NHS 酯按 1:2 的摩尔比（蛋白质:染料）在避光条件下搅拌混合。
在室温下以 8,000 × g 离心 10 分钟，沉淀标记后的纳米颗粒，弃去上清液，并保留上清液用于检测标记效率。
通过涡旋并反复吹吸，将标记后的纳米颗粒重悬于 1 mL 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液中，随后在室温下以 8,000 × g 离心 10 分钟去除上清液。重复此步骤 5 次。
将沉淀重悬于 15 mL 离心管中的 5 mL 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液中，并将荧光纳米颗粒分装至 1.5 mL 离心管中（共 30 份）。在室温下以 8,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，避光保存于 -80 °C。

4. 斑马鱼麻醉与经口插管

快速处理鱼类>0.5 g）至少在实验前48小时喂食，以排空肠道。
将鱼（12条）转移至实验用鱼缸（6 L）中，于实验前一晚进行适应性驯养12。
充分涡旋振荡纳米颗粒溶液（例如， 2,500 rpm 和 30 s）并吸取所需体积的纳米颗粒悬浮液（例如， 将20–50 µL注入连接在保护针头上的注射器中。
将鱼放入充气的150 mg/L MS-222溶液中（见第1节），直至其沉入水箱底部且对尾鳍夹捏无反应；此过程耗时少于5分钟。
用网将麻醉后的鱼迅速转移到湿润的塑料托盘中，使鱼体水平放置并朝向针头，立即开始经口插管。
用一只手小心托住鱼体，另一只手使用已防护的针头轻轻打开鱼口。将针头沿食道缓慢插入，至距口部开口约1厘米处。
注意： 当移液器尖端通过鳃部时，操作者可能会感到轻微阻力。注意不要过度倾斜进针角度，以免刺穿鳃部。
缓慢将纳米颗粒悬浮液注入鱼体内，确保悬浮液不会从鳃部或口腔流出。
轻轻取出针头，将鱼放入恢复缸中（见第1节）。恢复通常需要1分钟。
仔细检查鱼类是否存在任何异常例如，鳃部出血是穿孔的征象）。
待鱼恢复后，将其放回实验水箱。

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