在免疫功能健全的啮齿类动物模型中支气管内接种Streptococcus pneumoniae

摘要

来源：Hoover, J. L.，等，在免疫功能健全的啮齿类动物中建立稳健的肺炎模型以评估针对S. pneumoniae、H. influenzae、K. pneumoniae、P. aeruginosa或A. baumannii的抗菌疗效。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了在免疫功能健全的啮齿类动物模型中建立肺部感染的方法 通过 气管插管并将细菌悬液注入肺叶。该模型可用于免疫功能健全动物的抗菌疗效研究。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 麻醉、插管并接种动物

注意： 建议使用体重为100–120 g的SPF级免疫功能健全的雄性Sprague-Dawley大鼠。为所有动物提供食物和水 随意摄取 在木屑或其他吸水性垫料上群养，并维持标准的12小时光照-12小时黑暗循环。

1. 在开展任何实验之前，获取并灭菌适用于该动物物种的适当尺寸的金属套管和聚乙烯导管。准备无菌的一次性1 mL注射器和无菌的一次性25号针头。
   注意： 务必将这些注射器和针头丢弃至锐器容器中。
   1. 对于大鼠，购买或自制一根长约12 cm、内径0.9–1.0 mm、外径1.0–1.2 mm的金属套管，其一端弯曲成约45°角。取一段11至12英寸长的聚乙烯管，内径0.4 mm，外径0.8 mm。（参见 图1A。)
   2. 将金属套管置于带螺口盖的玻璃管中，通过标准方法进行高压灭菌以实现消毒。将切割好的聚乙烯导管段浸泡并保存在盛有酒精的带盖烧杯中。
2. 准备操作台面和插管装置。
   1. 将一块干净的一次性垫子放置在靠近水浴的工作台面上。将装在玻璃储存管中的金属导管转移至该工作区域。取下储存管的管帽，将导管的“手柄”端滑向储存管的开口端。
   2. 使用无菌镊子从烧杯中取出一段聚乙烯导管，将其穿入无菌金属套管针内，确保其可自由移动。将无菌一次性25号针头（用于大鼠）套在聚乙烯导管的游离端，使针头向内插入导管数毫米。（参见 图1A 大鼠
   3. 在金属套管和聚乙烯导管上标记引导线，以指示动物体内的插入深度。具体操作如下：先在一只已实施安乐死的动物身上按照下述插管步骤进行操作，打开胸腔以供观察，随后正确放置金属套管，并适当地推进聚乙烯导管。使用永久性记号笔，在金属套管与动物口腔交界处以及聚乙烯导管与金属套管顶端交界处分别做标记，以便在后续实验动物中实现准确放置。
3. 在通风橱内（或使用适当的废气清除系统），将最多6只动物置于密闭麻醉室中，以1.5 L/min的氧气流速供应不超过5%的异氟烷，直至咽反射被抑制（约1分钟）。
   注意： 在开展任何实验之前，需根据所使用的特定条件确定异氟烷的安全剂量和暴露时间（例如 腔室的尺寸/类型以及动物的大小/物种/品系，以防止意外致死暴露。
4. 用无菌的一次性1 mL注射器（适用于大鼠），将无菌针头插入生理盐水中，回拉活塞吸取生理盐水。将注射器连接到安装在聚乙烯导管上的针头上，推动注射器，使全部生理盐水通过导管，直至注射器排空。
5. 从水浴中的容器内吸取琼脂基接种物至注射器中，并将琼脂冲洗通过管路，直至管路完全充满（即完成引管）例如 完全填满琼脂。
   1. 对于大鼠，将连接在聚乙烯导管上的25号针头从一次性注射器上取下，并将使用过的注射器丢弃至锐器容器中。将新的无菌一次性1 mL注射器的无菌针头插入水浴中容器内的琼脂接种液，回抽活塞吸取接种液。重新将连接聚乙烯导管的针头装回注射器，然后推动活塞，使琼脂溶液流经导管，直至导管完全充满琼脂为止。
6. 从麻醉室中取出一只动物，将其仰卧置于一次性垫上，头部朝右，尾部朝左，如图所示 图1C.
7. 使用插管装置（即 金属套管连接聚乙烯导管），对动物进行插管，并将套管插入左肺的下叶（参见 图1D).
   1. 将金属导管的自由端插入动物口腔。旋转导管，使其自由端朝上，轻轻向前推进进入气管，同时以轻微扭转动作小心绕过喉部结构。通过用左手食指触诊气管环，并如图所示轻轻前后滑动导管数次，确认导管进入气管而非食管 图1C.
   2. 当套管到达气管分叉处（即气管分为左、右支气管的位置）时，轻轻向动物左侧扭转，以确保套管插入左支气管。推进金属套管，直至其末端到达左肺长度的一半至四分之三处，参考此前标记的引导线，确认已达到适当深度。
   3. 金属套管就位后，将聚乙烯导管向前推进数毫米。利用导管上预先标记的参考线，确保导管仅推进至刚好从金属套管末端伸出，避免刺破肺组织。
8. 双套管就位后，使用连接的注射器将100 µL（大鼠）琼脂悬浮液注入左肺大叶深部（参见 图1D撤出数毫米的聚乙烯导管，然后轻柔地取出完整的插管装置。将其放回玻璃储存管中，并将动物转移至新的笼具中恢复。

结果

图1： 非手术性气管内插管。 图中展示了用于大鼠(A)和小鼠(B)的插管工具。动物麻醉后，应按图C所示体位放置，若操作者为右利手，则头部朝右，尾部朝左。将左手食指轻轻置于喉部，以触诊气管软骨环，确认套管位置正确。接种物应注入左肺深部，如大鼠肺的腹面观所示(D)。样本经连续稀释并接种于琼脂平板后，菌落生长情况应与图E所示相似。图1D，版权 © Gill Smith [《实验动物》，第25卷（1991年），G. Smith，《建立大鼠呼吸道感染的简易非手术...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
引导工具	Intek Services Ltd	GT01
1 mL TB 注射器滑动接头	Becton Dickinson and Company	309659
PrecisionGlide 针头 25 G x 5/8	Becton Dickinson and Company	305122
Intramedic 聚乙烯导管	Clay Adams 品牌 - Becton Dickinson and Company	427401	小鼠用塑料套管
动物饲喂针头 - 直型 20 x 3" 2-1/4	Popper and Sons, Inc	7903	用于制作小鼠金属套管
75 TN 5.0 µL 注射器 26s/2"/2	Hamilton	87930	HPLC 玻璃进样注射器
Difco 营养琼脂	Becton Dickinson and Company	213000
Pyrex 试管，培养用 25x150 带螺帽并衬橡胶垫圈	Corning	9825-25	用于金属套管的高压灭菌/储存
PrecisionGlide 针头 25 G x 5/8	Becton Dickinson and Company	305122
70% 异丙醇	Vi-Jon (Swan)	NDC 0869-0810-43
异氟烷，USP	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10
50 mL 聚丙烯圆锥形离心管 30 x 115 mm	Falcon, a Corning Brand	352070
75 TN 5.0 µL 注射器 26s/2"/2	Hamilton	87930	HPLC 玻璃进样注射器