用于免疫病理学研究的大鼠十二指肠内插管模型

摘要

来源：Trevaskis, N. L. 等，肠系膜淋巴导管插管大鼠模型：用于评估肠道淋巴药物转运。J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了在大鼠模型中进行十二指肠插管的操作。在对大鼠实施麻醉后，定位其十二指肠并制造一个小的穿刺口。将一根带有斜面尖端的J形导管小心插入并固定，随后关闭切口。这种插管大鼠模型可用于肠道内灌注，以开展免疫病理学研究。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术前一天的准备工作

1. 若需要，于手术前一晚对大鼠进行禁食处理。确保大鼠可自由饮水。
2. 准备将要给予大鼠的溶液。
   1. 准备一种再水化溶液，例如无菌生理盐水或林格氏液。
   2. 根据需要准备麻醉剂溶液。本实验中使用的麻醉剂为“鸡尾酒1”（Cocktail 1），其成分为1.9 ml 的氯胺酮（100 mg/ml）、0.5 ml 的赛拉嗪（Xylazine，100 mg/ml）、0.2 ml 的乙酰丙嗪（acepromazine，10 mg/ml）以及2.5 ml 生理盐水；另一种为“鸡尾酒2”（Cocktail 2），由1 ml 氯胺酮（100 mg/ml）和0.1 ml 乙酰丙嗪（10 mg/ml）组成。注意：吸入用异氟烷或七氟烷可能更优，因其可维持更长时间的外科麻醉深度。
3. 准备抗凝溶液：含10 mg/ml 乙二胺四乙酸（EDTA）的无菌水溶液或含10 IU/ml 肝素的生理盐水，用于冲洗淋巴导管；另准备含2.5 - 10 IU/ml 肝素的生理盐水，用于冲洗颈动脉导管。
4. 准备用于插入十二指肠的聚乙烯导管（外径0.96 mm，内径0.58 mm）。
   1. 将导管剪至所需长度（通常十二指肠导管为25 - 30 cm），并使用无菌手术刀片在导管尖端制作斜面（见图1）。
      注意：此举可提高导管插入的便利性，并降低插入后导管堵塞的发生率。
   2. 通过将导管一小段弯曲回折形成环状，用打火机或加热板加热定型，制成J形固定点，用于十二指肠内导管的锚定（见图1）。
5. 将淋巴导管连接至含有抗凝溶液（按步骤1.3制备）的25 G针头和注射器上。用抗凝溶液充满淋巴导管，并将溶液留置于导管中过夜（O/N），以减少淋巴采集过程中淋巴导管内血栓形成的风险。
6. 准备用于收集淋巴液和血液样本的试管。预先称量淋巴收集管，标记用于淋巴液和血液样本收集的试管，并加入抗凝溶液。加入足量抗凝溶液，使最终浓度达到在无菌水中含1 mg/ml 乙二胺四乙酸（EDTA），或在收集的淋巴液或血液中含10 - 20 IU/ml 肝素。

2. 手术开始前的即时准备工作

1. 通过用无菌生理盐水或抗凝剂溶液冲洗套管，检查其是否通畅。
2. 准备大鼠以进行手术操作。
   1. 在整个手术和样本采集期间，对大鼠持续实施麻醉。
      1. 例如，使用连接25 G针头的1 ml注射器，将1.5 ml/kg的 Cocktail I（来自步骤1.2.2）皮下注射至大鼠颈部背部的皮肤皱褶处以诱导麻醉；根据需要，每隔约一小时使用连接25 G针头的1 ml注射器，通过腹腔注射0.44 ml/kg的 Cocktail 2（来自步骤1.2.2）以维持麻醉。
      2. 在开始手术前，通过观察呼吸频率、胡须运动、肌肉张力以及对足部夹捏等刺激的反应，确认麻醉深度是否足够；根据需要追加麻醉剂。
   2. 剃除手术区域的毛发，包括腹部右侧，用于十二指肠插管。
   3. 使用聚维酮碘溶液或氯己定溶液及70%乙醇擦拭，对手术区域进行无菌清洁。每个区域重复此过程3次，最后用70%乙醇完成终末清洁。
3. 将动物仰卧置于清洁垫单上，并放置在加热的手术垫（37 °C）上方。

3. 十二指肠插管

1. 将动物置于其右侧朝向操作者的位置。根据需要，可在手术显微镜下或不使用手术显微镜进行手术。
2. 使用无菌手术刀片沿中线（剑突）至右侧腹侧、约在肋缘下方 2 cm 处作一条 4 cm 长的直线切口，切开腹壁肌肉的表层（见图 2B）。
3. 使用小型手术剪从距中线外侧 4 - 5 mm 处开始，向右侧腹侧方向剪开腹壁肌肉的其余各层，直至右 flank 区域（见图 2B）。
4. 将小肠向左腹壁肌肉下方牵开，并用 2 - 3 块浸有生理盐水的无菌纱布固定其位置。
5. 将十二指肠插管连接至装有再水化溶液的注射器（例如，10 ml）上。
6. 辨认十二指肠：其为小肠中呈亮粉色（血管较多）的部分，轻柔向下牵拉时可显露出胃部。
7. 使用无菌 23 G 针头在胃与十二指肠交界处（幽门）下方约 2 cm 处的十二指肠壁上刺一个小孔。
8. 将十二指肠插管的 J 形钩状末端经由穿刺孔插入，并用一滴氰基丙烯酸酯胶水固定。
9. 将插管连接至装有再水化溶液并置于输液泵中的注射器，开始对大鼠进行补液。根据文献报道，补液速率范围为 0.5 - 3 ml/hr。
10. 完成淋巴管和十二指肠插管后，用缝线关闭腹壁肌肉上的切口；随后沿切口边缘滴加数滴组织粘合剂（氰基丙烯酸酯），并将切口两侧皮肤捏合在一起，以闭合皮肤切口。

结果

图1. 颈动脉或淋巴导管斜面尖端形状的示意图，以及十二指肠导管J形斜面尖端的示意图。

图 2. （A）腹部剃毛以准备插管淋巴导管，（B）沿中线至右侧腹侧做一条4 cm长的直线切口，打开腹壁肌肉以暴露淋巴导管，以及（C）位于右肾垂...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌生理盐水	Baxter healthcare	AHB 1307	可使用任意品牌。此处示例为Baxter 100 ml生理盐水袋，每盒50袋
70% 乙醇水溶液	任意		可使用任意品牌
葡萄糖酸氯己定溶液（Microshield 4）	Livingstone International	JJ60243L	可使用任意品牌。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
聚维酮碘溶液	Livingstone International	BU0510	可使用任意品牌。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
Ilium Ketamil（氯胺酮 100 mg/ml）	PROVET VICTORIA	KETA I 1	http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil（赛拉嗪 100 mg/ml）	PROVET VICTORIA	TRO-3828	http://www.provet.com.au/
ACP 10 注射液（乙酰丙嗪 10 mg/ml）	PROVET VICTORIA	VTG-DACP010020	http://www.provet.com.au/
肝素（35000 I.U. / 35 mL）	Sigma Pharmaceuticals	337220	http://sigmaco.com.au/
乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐二水合物	Sigma-Aldrich	E1644	可使用任意品牌。此处示例为Sigma生产的EDTA二钠盐。
聚乙烯（PE）导管，外径0.96 mm × 内径0.58 mm	Microtube extensions	PE8050	可使用任意品牌。此处示例为PE导管0.8×0.5 mm，30 m
聚乙烯（PE）导管，外径0.8 mm × 内径0.5 mm	Microtube extensions	PE9658	可使用任意品牌。此处示例为PE导管0.96×0.58 mm，30 m
直尺	任意		可使用任意品牌
标记笔	任意		可使用任意品牌
打火机	任意		可使用任意品牌
氰基丙烯酸酯胶水	任意		可使用任意品牌
23号针头	Livingstone International	DN23GX0.75LV	可使用任意品牌。此处示例为Livingstone一次性针头，无菌，23GX0.75英寸，每盒100支。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DN23GX0.75LV
25号针头	Livingstone International	DN25GX1.0LV	可使用任意品牌。此处示例为Livingstone一次性针头，无菌，25GX1.0英寸，每盒100支。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DN25GX1.0LV
1 ml 注射器	Livingstone International	T3SS01TA	可使用任意品牌。此处示例为Terumo 1 ml滑动式结核菌素注射器，每盒100支。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA
10 ml 注射器	Livingstone International	T3SS10SA	可使用任意品牌。此处示例为Terumo 10 ml滑动式注射器，每盒100支。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA
纱布敷料	Livingstone International	GSC075	可使用任意品牌，并裁剪至所需尺寸。此处示例为棉芯纱布敷料，7.5×7.5 cm，8层。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075
加热垫	Ratek	WT1	可使用任何能维持37°C温度的加热设备。此处示例为Ratek加热托盘。
手术灯	Harvard Apparatus	72-0215 with 72-0267	可使用任意品牌。此处示例为Harvard Apparatus V-Lux 1000冷光源，配备双分支鹅颈导光管，黑色，光纤直径4.7 mm（每臂）。http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
手术显微镜	Zeiss	495005-0014-000	可使用任意品牌。此处示例为Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C，配备S Double Spot支架和KL 300 LED光源。https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
丝线缝合线	Livingstone International	DTSK163019F4	可使用任意品牌。此处示例为* Email this item to my friend 3/8圆形反向切割丝线缝合线，3/0线径，19 mm。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4
手术刀片	Fine Science Tools (FST)	10020-00	可使用任意品牌。此处示例为FST手术刀片#20。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
手术刀柄	Fine Science Tools (FST)	10004-13	可使用任意品牌。此处示例为FST手术刀柄#4。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 把小型手术剪	Fine Science Tools (FST)	14060-09	可使用任意品牌。此处示例为FST精细剪刀，长9 cm，刃长21 mm，尖端锋利、直头。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 把带锯齿弯头镊子	Fine Science Tools (FST)	11001-13	可使用任意品牌。并非所有操作者都会使用此类镊子。此处示例为FST 13 cm标准型镊子，弯头尺寸为2.8×1.4 mm。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
2 把止血钳	Fine Science Tools (FST)	13010-12	可使用任意品牌。并非所有操作者都会使用止血钳。此处示例为FST 12 cm微型蚊式止血钳，带锯齿直头，长20 mm，宽1.3 mm。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 把持针器	Fine Science Tools (FST)	12001-13	可使用任意品牌。此处示例为FST 13 cm Hasley持针器，尖端尺寸为16 mm × 1.9 mm。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70