一种在大鼠中诱导慢性实验性自身免疫性干眼症的技术

摘要

来源：Hou, A., 等 一种具有眼组织效应记忆T细胞增加的慢性自身免疫性干眼大鼠模型。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了一种在大鼠中诱导慢性实验性自身免疫性干眼病的技术。通过在预定时间间隔向大鼠注射含有自身抗原和外来抗原的抗原-佐剂乳剂，随后将相同抗原注射至眼部表面组织，可在免疫大鼠中诱导产生慢性眼表炎症。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 泪腺提取物的制备

注意：大鼠通过腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。通过夹捏脚趾和尾部确认麻醉效果。每次操作后，向大鼠眼部涂抹眼用凝胶以防止角膜干燥。麻醉后的大鼠置于远红外灯下保温，直至完全恢复意识。在操作过程及恢复期间，研究人员对动物进行密切监测。所有材料和手术器械在使用前均保持无菌状态。实验结束时，通过腹腔注射戊巴比妥（80 mg/kg）实施安乐死。通过检测无心搏及触碰眼球无眨眼反射来确认安乐死完成。大鼠饲养于标准环境中：室温21–23 °C，相对湿度30–70%，光照-黑暗循环为12小时交替（上午7点至晚上7点）。

1. 将安乐死的雌性Sprague-Dawley大鼠（年龄范围为8至16周）平放，一耳紧贴桌面，另一耳朝上。用弹簧剪刀在暴露的耳下沿头尾方向做一条10 mm的切口。从周围结缔组织及排液管中分离，取出泪腺。
   1. 将腺体储存于-80 °C，直至使用。在冰上解冻腺体，并在冰上用剪刀尽可能剪碎。每份泪腺加入150 µL含1×蛋白酶抑制剂的PBS。
2. 将样品置于冰上，用超声波破碎仪在20 kHz、30%振幅条件下进行超声处理，工作模式为开启10秒、关闭10秒，总时长5分钟。将超声处理后的样品在4 °C、13,000 × g条件下离心20分钟。
3. 用移液器吸取上清液并转移至新管中。将上清液分装至1.5 mL离心管，于-80 °C保存。按照制造商说明书，使用二辛可宁酸法测定蛋白浓度。

2. 乳剂和百日咳毒素的制备

1. 乳化
   1. 将40 mg热灭活的Mycobacterium tuberculosis H37Ra加入到10 mL含1 mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra的完全弗氏佐剂中，充分混匀。
      注意：最终完全弗氏佐剂中Mycobacterium tuberculosis H37Ra浓度为5 mg/mL。
   2. 称取卵清蛋白，用PBS溶解，配制含2 mg/mL卵清蛋白和10 mg/mL泪腺提取物的抗原混合液。根据动物数量，按每只动物注射200 µL的剂量配制总混合液。
   3. 将不完全弗氏佐剂或完全弗氏佐剂转移至50 mL离心管中，确保佐剂与抗原混合液体积比为1:1。在最大速度涡旋振荡的同时，逐滴将抗原混合液加入佐剂中，避免溅出。待全部抗原加入后，继续涡旋振荡5分钟。
   4. 将乳化液转移至5 mL注射器中，并通过注射器连接器与另一支5 mL注射器连接，来回推动乳化液以充分混匀。
      注意：若将单滴乳化液滴入水中后仍保持球形不扩散，则表明乳化完成。仅可使用新鲜配制或4 °C过夜保存的乳化液。
2. 百日咳毒素
   1. 用500 µL水溶解50 µg百日咳毒素，配制成终浓度为100 ng/µL的溶液。涡旋振荡容器30秒，确保毒素完全溶解。
      注意：不可通过过滤方式进行灭菌，否则会导致物质损失。不可冷冻。该溶液在4 °C下至少可保持活性6个月。
   2. 用PBS将100 ng/µL的百日咳毒素稀释至3 ng/µL。取100 µL稀释后的百日咳毒素，加入带有27 G针头的1 mL鲁尔锁型注射器中。

3. 沃斯塔大鼠的免疫

1. 第0天，将乳剂混匀数次。取200 µL乳剂（含1 mg泪腺提取物和200 µg卵清蛋白，溶于完全弗氏佐剂中），分装至带27G针头的1 mL鲁尔锁型注射器中。无需麻醉，将乳剂皮下注射于大鼠尾根部。
   注意：注射前无需预热尾部。每只大鼠免疫剂量为1 mg泪腺提取物和200 µg卵清蛋白，溶于含500 µg Mycobacterium tuberculosis H37Ra的完全弗氏佐剂中。
2. 第14天，以与第0天相同的方式注射200 µL乳剂（含1 mg泪腺提取物和200 µg卵清蛋白，溶于不完全弗氏佐剂中）。同日，每只大鼠腹腔注射含300 ng百日咳毒素的100 µL PBS溶液。

4. 将抗原混合物注射至穹隆部结膜下及泪腺以募集抗原特异性免疫细胞并引发局部炎症

1. 根据实验所用大鼠数量计算所需卵清蛋白和泪腺提取物的用量。称取所需量的卵清蛋白，与步骤1中制备的解冻泪腺提取物混合，配制成含1 mg/mL卵清蛋白和1 mg/mL泪腺提取物的抗原溶液。
2. 用氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）通过腹腔注射麻醉大鼠。夹捏大鼠脚趾以确认已达到适当的麻醉状态（即， 捏压后无反应性运动）。向眼部穹隆部结膜下注射 5 µL 抗原。向泪腺注射 20 µL 抗原。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
蛋白酶抑制剂混合物	西格玛奥德里奇	货号 P2714-1BTL
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	热成像科学	23227
结核分枝杆菌 H37Ra	Becton， Dickinson and company	231141
完成弗洛伊德氏副剂	Becton， Dickinson and company	231131
ovalbumin	西格玛奥德里奇	货号 A5503-10G
不完整的弗洛伊德氏佐剂	西格玛奥德里奇	F5506-6X10ML
百日咳毒素	西格玛奥德里奇	货号 P7208-50UG
荧光素钠溶液	Bausch & Lomb 英国有限公司	NA
设备
超声波仪	音速	Vibra-Cell
微型 IV 显微镜	凤凰研究实验室	不适用