自身免疫性干眼大鼠模型中角膜与泪膜光滑度的评估

摘要

来源：Hou, A. 等，一种具有眼组织效应记忆T细胞增加的慢性自身免疫性干眼大鼠模型 J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种在自身免疫性大鼠模型中评估角膜光滑度和泪膜稳定性的方法。该方法强调了腺体功能障碍对泪膜稳定性的影响，对于理解干眼症具有重要意义。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 泪腺提取物的制备

注意： 大鼠通过腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。通过夹捏脚趾和尾部确认麻醉效果。每次操作后，向大鼠眼部涂抹眼用凝胶以防止角膜干燥。麻醉后的大鼠置于远红外线灯下保温，直至完全恢复意识。在实验操作及恢复期间，研究人员对动物进行密切监测。所有材料和手术器械在使用前均保持无菌状态。实验结束时，通过腹腔注射戊巴比妥（80 mg/kg）对大鼠实施安乐死。通过无心跳脉搏及无角膜反射确认安乐死完成 通过触碰眼球引出眨眼反射。大鼠饲养于标准环境中：室温21-23 °C；相对湿度30-70%；明暗循环周期，交替12小时（上午7点至晚上7点）。

1. 将安乐死的雌性Sprague-Dawley大鼠（年龄范围为8至16周）平放，一耳紧贴桌面，另一耳朝上。用弹簧剪刀在暴露的耳下沿头尾方向做一条10 mm的切口。从周围结缔组织及排液管中分离，取出泪腺。
   1. 将腺体储存于-80 °C，直至使用。在冰上解冻腺体，并在冰上用剪刀尽可能剪碎。每份泪腺加入150 µL含1×蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 将样品置于冰上进行超声处理，超声条件为20 kHz，工作10秒、间歇10秒，振幅30%，总时长5分钟。超声处理后的样品在4 °C、13,000 × g条件下离心20分钟。
3. 用移液器吸取上清液并转移至新管中。将上清液分装至1.5 mL离心管，于-80 °C保存。按照制造商说明书，采用二辛可宁酸法（bicinchoninic acid assay）测定蛋白浓度。

2. 乳剂和百日咳毒素的制备

1. 乳化
   1. 将40 mg热灭活的 Mycobacterium tuberculosis H37Ra加入含1 mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra的10 mL完全弗氏佐剂中，并充分混匀。
      注意：最终完全弗氏佐剂中 Mycobacterium tuberculosis H37Ra的浓度为5 mg/mL。
   2. 称取卵清蛋白，用PBS溶解，配制含2 mg/mL卵清蛋白和10 mg/mL泪腺提取物的抗原混合液。根据动物数量，按每只动物注射200 µL的剂量配制总混合液。
   3. 将不完全弗氏佐剂或完全弗氏佐剂转移至50 mL离心管中，确保佐剂与抗原混合液的体积比为1:1。在高速涡旋振荡的同时，逐滴将抗原混合液加入佐剂中，避免溅出。待全部抗原加入后，继续涡旋振荡5分钟。
   4. 将乳化液转移至5 mL注射器中，并通过注射器连接器与另一支5 mL注射器相连，来回推动乳化液以充分混匀。 
      注意：若将单滴乳化液滴入水中后仍保持球形不扩散，则表明乳化完成。仅可使用新鲜配制的乳化液或4 °C下保存过夜的乳化液。
2. 百日咳毒素
   1. 将50 µg百日咳毒素溶于500 µL水中，配制成终浓度为100 ng/µL的溶液。涡旋振荡容器30秒，确保毒素完全溶解。
      注意：不可通过过滤方式进行灭菌，否则会导致物质损失。不可冷冻。该溶液在4 °C下至少可保持活性6个月。
   2. 用PBS将100 ng/µL的百日咳毒素稀释至3 ng/µL。取100 µL稀释后的百日咳毒素，转移至带有27 G针头的1 mL鲁尔锁型注射器中。

3. 沃斯塔大鼠的免疫

1. 第0天，将乳剂混匀数次。取200 µL乳剂（含1 mg泪腺提取物和200 µg卵清蛋白，溶于完全弗氏佐剂中），分装至带27G针头的1 mL鲁尔锁型注射器中。在无麻醉状态下，将乳剂皮下注射于大鼠尾根部。
   注意：注射前无需预热尾部。每只大鼠接种剂量为1 mg泪腺提取物和200 µg卵清蛋白，溶于含500 µg Mycobacterium tuberculosis H37Ra的完全弗氏佐剂中。
2. 第14天，以与第0天相同的方式注射200 µL乳剂（含1 mg泪腺提取物和200 µg卵清蛋白，溶于不完全弗氏佐剂中）。同日，每只大鼠腹腔注射含300 ng百日咳毒素的100 µL PBS溶液。

4. 将抗原混合物注射至穹窿部结膜下及泪腺以募集抗原特异性免疫细胞并引发局部炎症

1. 根据实验中使用的大鼠数量，计算所需卵清蛋白和泪腺提取物的用量。称取所需量的卵清蛋白，并与步骤1中制备的已解冻泪腺提取物混合，配制成含有1 mg/mL卵清蛋白和1 mg/mL泪腺提取物的抗原溶液。
2. 通过腹腔注射给予氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）麻醉大鼠。轻捏大鼠脚趾以确认麻醉效果（即 捏趾后无反应性动作）。向眼部穹隆结膜下注射5 µL抗原，向泪腺内注射20 µL抗原。

5. 干眼症特征的评估

注意： 应将麻醉后的大鼠置于平坦表面，用戴手套的手轻轻握住，保持直立姿势，以避免移动。

1. 使用酚红棉线测量泪液体积。
   1. 用一对镊子夹住棉线，另一对镊子拉开大鼠的下眼睑。将棉线置于下穹窿的近端角落处1分钟，然后取出棉线。
      注意： 泪液会使棉线湿润部分变为红色。
   2. 将棉线湿润部分的长度与带有毫米刻度的尺子一同拍照。使用图像软件（例如 ImageJ）测量湿润长度，精确至十分之一毫米。
2. 测量角膜/泪膜光滑度。
   1. 将大鼠置于配备环形照明器和相机的体视显微镜下。在大鼠角膜上滴加5 µL生理盐水。戴上手套后用手指轻轻移动上下眼睑约5次，被动眨眼以使生理盐水均匀分布。
   2. 在1.6倍放大倍数下，将环形照明器聚焦于角膜表面中央区域。10秒后采集图像。
      注意： 环形照明器会在动物角膜上投射出两圈圆形的光点图像。若光点间距规则且无畸变，表明角膜/泪膜层光滑。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒	Thermal Scientific	23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Becton, Dickinson and company	231141
完全弗氏佐剂	Becton, Dickinson and company	231131
卵清蛋白	Sigma-Aldrich	A5503-10G
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5506-6X10ML
百日咳毒素	Sigma-Aldrich	P7208-50UG
仪器设备
超声破碎仪	Sonics	Vibra-Cell
带环形光源照明和相机的体视显微镜	Carl Zeiss	NA