实时成像巨噬细胞对IgG调理红细胞的吞噬作用

摘要

来源：Horsthemke, M.，等。小鼠巨噬细胞吞噬作用的延时三维成像。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种用于监测巨噬细胞介导的红细胞（RBC）吞噬作用独立事件的实验方法。将经小鼠免疫球蛋白G（IgG）包被的人源红细胞与小鼠巨噬细胞共孵育，并在共聚焦显微镜下观察。红细胞被巨噬细胞吞噬 通过 吞噬杯的形成并被靶向溶酶体降解。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 在通道载玻片中接种腹膜细胞

1. 用移液枪将小鼠腹腔巨噬细胞悬浮液反复吹打以减少细胞团块后，取100 µL细胞悬液加入已预装100 µL液体的纤连蛋白包被的通道载玻片的通道中（100 µL通道的尺寸为：长 × 宽 × 高 = 50 mm × 5 mm × 0.4 mm）。
   1. 通过向通道载玻片的两个储液槽之一加入1 mL含血清的RPMI 1640（Hepes）培养基，倾斜载玻片，然后从下游储液槽中吸出培养基，以预填充腔室 （图1）.
      1. 通过向两个储液池中的其中一个加入1–2 mL培养基，盖紧储液池盖，然后有节奏地用拇指按压盖子，必要时倾斜载片，以排出通道内的多余气泡或长条状空气。排尽空气后，在移除盖子前，将未加盖且含有培养基的储液池一端朝下倾斜，以避免空气被重新吸入通道。
2. 将接种有细胞的通道载玻片置于湿润的孵育盒中，在 37 °C 下孵育 2 小时，无需 CO₂ (CO₂ 由于HCO₃-/CO₂ 缓冲体系被替换为HEPES）。通道式载玻片可方便地放置在可容纳八张载玻片的支架上。通常每只小鼠可制备6–8张载玻片，但也可制备10张或更多。
3. 取出支架，将每张载玻片中的 RPMI 1640 (Hepes) 培养基更换为含碳酸氢盐的 RPMI 1640 培养基，补充 10% 胎牛血清以及青霉素/链霉素。
   1. 倾斜载玻片，先从下部储液池吸出培养基，再从上部储液池吸出培养基。随后，向其中一个储液池加入1 mL新鲜培养基，倾斜载玻片，待培养基流经通道后，从下游储液池吸出培养基。
   2. 经过此洗涤（换液）步骤后，向其中一个储液池中加入 1 mL 培养基，使通道载玻片充满。
      注意： 使用通道载玻片进行洗涤步骤在溶液置换和去除非黏附细胞方面非常简单且高效。注意，RPMI 1640（碳酸氢盐）培养基通常需预先在5% CO₂环境中孵育₂ 过夜以确保达到热平衡和pH平衡。
4. 在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中过夜培养细胞₂第二天进行实验。

2. 人红细胞的分离

1. 在第2天（分离腹腔巨噬细胞过夜培养后的实验第二天），从健康供体采集1–2 mL外周静脉血至含肝素的采血管中。取1 mL转移至圆底2.0 mL（聚丙烯）微量离心管中，在18 °C（经验设定）下以300 x g离心5 min，弃去上清液（血浆和白细胞层）。
2. 轻轻吸取100 µL沉淀的红细胞，加入至圆底2.0 mL微量离心管中，与等体积的改良RPMI 1640（Hepes）培养基（见下文描述）混匀。将该管标记为“1:1”。
   注意： 第2天（用于检测）在分离细胞后使用的RPMI 1640 (Hepes) 培养基，除含10%热灭活胎牛血清外，还包含青霉素（100单位/mL）、链霉素（100 µg/mL）和1 mM N-(2-巯基丙酰基)甘氨酸（用于减少光毒性）。此后，该培养基称为“改良的”RPMI 1640 (Hepes) 培养基。
3. 将4 µL 1:1稀释的红细胞悬液加入预先分装于2.0 mL微量离心管中的2 mL改良RPMI 1640（Hepes）培养基中（重复此步骤， 即 准备2个离心管，分别标记为“4:2000”。将“1:1”和“4:2000”离心管置于冰上。

3. 巨噬细胞质膜的标记

1. 从 CO₂ 培养箱中取出已接种的通道载玻片，将每张载玻片中的 RPMI 1640（碳酸氢盐）培养基更换为改良 RPMI 1640（Hepes）培养基。随后，将细胞置于 37 °C 无 CO₂ 的湿润环境中。
   注意： 经过过夜培养和洗涤后，大部分淋巴细胞已被从通道中去除。剩余的贴壁细胞主要为巨噬细胞，可通过形态学特征或使用抗 F4/80 抗体进行免疫荧光染色来鉴定。约 95% 的小鼠腹腔常驻巨噬细胞为 F4/80 阳性。
2. 用改良 RPMI 1640（Hepes）培养基将荧光绿色标记的抗小鼠 F4/80 抗体（4 °C 保存）按 1:40 比例稀释。取一张载玻片，倾斜后用移液器逐滴加入 100 µL 抗体混合液至载玻片 100 µL 通道的入口处 （见图 1）。吸除流入下游储液池的液体。将细胞在 37 °C（无 CO₂ 的湿润环境）下孵育 20 分钟。在孵育期间，对人红细胞进行标记（见第 5 节）。
   注意： 如上所述，由于 Hepes 已替代 HCO₃⁻/CO₂ 缓冲系统，因此无需 CO₂。
3. 20 分钟孵育时间结束后（此时人红细胞已完成染色和调理处理），通过向其中一个储液池加入 1 mL 改良 RPMI 1640（Hepes）培养基，并倾斜载玻片使液体流经通道后吸除流出的培养基，以洗涤载玻片。随后可加入 1 mL 培养基用于短期保存，或直接进行实验（即 加入颗粒物（调理后的红细胞）并通过时间延时旋转盘共聚焦显微镜成像观察吞噬作用）。

4. 人红细胞质膜的标记

1. 在将巨噬细胞载玻片与绿色荧光标记的抗F4/80抗体孵育后（参见第3.2节），立即开始对人红细胞进行标记。轻轻混匀后，从一个“4:2000”管中取出400 µL（参见第2.3节），加入至一个（圆底）2.0 mL微量离心管中。静置片刻，使悬液温度升至约37 °C（见下文段落）。加入0.4 µL橙色/红色荧光细胞膜染料（分装后储存于-20 °C），混匀后于37 °C孵育5分钟。
   注意： 层流罩内放置的加热铝块有助于在制备载玻片时减少热量散失。试管可插入加热块的孔井中，而独立或集成的加热铝板则可用作工作台面。
2. 5分钟孵育期结束后，通过加入1600 µL改良RPMI 1640（Hepes）培养基（以填满2.0 mL微量离心管）进行第一步洗涤。
3. 将试管在 300 x g 在18 °C下孵育5分钟（经验性设置）。管壁上应可见一个致密的红色沉淀。即， 将离心管底部的沉淀物（可能位于偏心位置）旋转至朝上，使用1–1.5 mL移液器吸头分两步依次小心吸除所有上清液。
4. 吸去上清液后，加入 2,000 µL 改良 RPMI 1640 (Hepes) 培养基，混匀（以重悬细胞），重复上述离心及吸除上清液步骤。
5. 将沉淀（经血浆膜染色并洗涤两次的红细胞）用400 µL改良RPMI 1640（Hepes）培养基重悬。将试管标记为PMS（血浆膜染色的缩写）。
   注意： 或者，可使用一种pH敏感型罗丹明衍生物的琥珀酰亚胺酯，该衍生物在酸性pH下荧光增强，用于标记人红细胞。在此情况下，荧光强度还可作为颗粒被内化后吞噬体成熟程度的检测指标。

5. 使用小鼠免疫球蛋白 G（IgG）对人红细胞进行调理（标记）

1. 向标记为 PMS 的试管中加入 1 µL 小鼠（IgG2b）单克隆（克隆号 HIR2）抗人 CD235a 抗体（1 mg/mL，储存于 -20 °C），该试管含有悬浮于 400 µL 培养基中并已进行血浆膜染色的人红细胞。CD235a（也称为血型糖蛋白 A）是一种红系谱系特异性的膜唾液酸糖蛋白。
2. 在 37 °C 下孵育 8 分钟。需注意，使用 IgG 对人红细胞进行调理作用会引起凝集（细胞成团）。尽管凝集可作为调理作用的视觉指示，但在观察单个吞噬效应时并不理想。为避免凝集，可使用例如设定为 200 µL 的 20–200 µL 可调移液器每隔 1 分钟反复混匀细胞悬液。
   1. 在 8 分钟孵育即将结束时，如需要，可用 1 mL 改良 RPMI 1640（Hepes）培养基洗涤已与绿色荧光标记的抗 F4/80 抗体孵育的巨噬细胞载玻片。洗涤步骤后应确保通道载玻片的两个储液池中均无残留培养基。

6. 成像吞噬经质膜染色并涂有IgG的人类红细胞

1. 与抗CD235a抗体孵育8分钟后（第5.2节），用移液器将100 µL含有细胞膜染色且经IgG调理的人红细胞悬液加入已接种经绿色荧光抗F4/80抗体标记巨噬细胞的通道载玻片中（步骤3）。因此，将红色荧光、经IgG调理的人红细胞加入至绿色荧光的吞噬细胞（巨噬细胞）中。
2. 一旦加入人红细胞，立即将通道载玻片安装至旋转盘共聚焦显微镜上（载物台培养箱设定为37 °C）进行成像，例如使用60倍/1.49数值孔径的油浸物镜。应尽快开始成像，因为颗粒在1分钟内即开始沉降。
   注意：使用直径为100 nm的荧光微球，通过点扩散函数分析测得XY分辨率：x = 0.22 µm，y = 0.23 µm（488 nm激光）和x = 0.27 µm，y = 0.27 µm（561 nm激光）。然而，为减少活细胞延时三维成像过程中的光漂白和光毒性，我们采用2×2像素合并（binning）以牺牲空间分辨率为代价。像素合并可提高灵敏度（改善信噪比）和允许更高的帧率，但会降低空间分辨率。
3. 使用完美对焦（或类似）系统以防止记录过程中焦点漂移。激活完美对焦系统后，使用偏移控制功能聚焦于通道载玻片盖玻片表面正上方的巨噬细胞片状伪足突起（见下文注释）。此焦平面对应Z = 0 µm。以0.8 µm为步长，采集从-1 µm到+16 µm的Z轴层扫图像，共22个Z层面。例如，可每15秒采集一次Z轴层扫图像（每个通道），持续16分钟。
   注意：较长的记录时间会导致图像质量下降，主要原因是光漂白。对两个通道分别采集Z轴层扫图像：使用488 nm激光（绿色通道）成像巨噬细胞，使用561 nm激光（红色通道）成像人红细胞。通过该方法，可获得巨噬细胞在不同时间点吞噬IgG调理人红细胞的多种视图 （例如，见图2）。
   注意：系统典型设置（采用2×2像素合并）如下：绿色通道（20.5%激光功率（50 mW；488 nm），灵敏度101（范围0–255），曝光时间200 ms）；红色通道（10.5%激光功率（50 mW；561 nm），灵敏度101（范围0–255），曝光时间98 ms）。
   注意：通道载玻片的底部为一种聚合物材料，其厚度与#1.5玻璃盖玻片相同，光学性质与玻璃相似，但特别具有气体通透性的优势。

结果

图 1：纤维连接蛋白包被通道载玻片的操作。（A）通道载玻片由两个储液池通过一个尺寸为 50 mm × 5 mm × 0.4 mm 的通道连接而成。通道载玻片最初通过向其中一个储液池加入 1–2 mL 培养基并倾斜载玻片进行预填充。（B）可在孵育前将盖帽安装到储液池上。盖帽可方便地用于在向通道接种细胞前排出不需要的气泡。（C）可通过直接将培养基移液至通道口，填充无气泡的 100 µL 通道。此步骤可用于例如将巨噬细胞接种到载玻片中，或加入荧光素（绿色荧光）标记的抗 F4/80 抗体，后者既作为膜标记物，也作为小鼠巨噬细胞标志物。（D）将颗粒（如调理化的人红细胞）移液至已接种荧光染色巨噬细胞的通道后，可将载玻片置于倒置显微镜载物台上，进行延时旋转盘共聚焦显微成像

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 G 塑料导管	B Braun Mesungen AG, Germany	4254503-01	用于腹腔灌洗
不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 Hank's 平衡盐溶液	Thermo Fisher Scientific	14170120	用于腹腔灌洗
14 mL 聚丙烯圆底管	BD Falcon	352059	用于收集腹腔细胞
含 20 mM Hepes 的 RPMI 1640 培养基	Sigma-Aldrich	R7388	实验基础培养基
热灭活胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10082139	用作 RPMI 1640 培养基的补充物
100 倍青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	用作 RPMI 1640 培养基的补充物
纤维连接蛋白包被的 µ-Slide I 型腔室载片	Ibidi, Martinsried, Germany	80102	用于实验的通道式载片
µ-Slide（阳极氧化铝）支架	Ibidi, Martinsried, Germany	80003	可高压灭菌的可堆叠通道载片支架
含碳酸氢盐的 RPMI 1640 培养基	Sigma-Aldrich	R8758	用于过夜培养的培养基
N-(2-巯基丙酰基)甘氨酸	Sigma-Aldrich	M6635	活性氧清除剂
Alexa Fluor 488 标记的大鼠（IgG2a）单克隆（克隆 BM8）抗小鼠 F4/80 抗体	Thermo Fisher Scientific	MF48020	小鼠巨噬细胞标志物及质膜标记
CellMask Orange	Thermo Fisher Scientific	C10045	红色荧光质膜染料
pHrodo 的琥珀酰亚胺酯	Thermo Fisher Scientific	P36600	pHrodo 的胺反应性琥珀酰亚胺酯
小鼠（IgG2b）单克隆（克隆 HIR2）抗人 CD235a 抗体	Thermo Fisher Scientific	MA1-20893	用于用人 IgG 包被人红细胞
Alexa Fluor 594 标记的山羊抗小鼠（二抗）IgG 抗体	Abcam	Ab150116	用于确认人红细胞被小鼠 IgG 包被
大鼠抗小鼠 C3b/iC3b/C3c 抗体	Hycult Biotech	HM1065	用于确认人红细胞被 C3b/iC3b 包被
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗大鼠 IgG 抗体	Thermo Fisher Scientific	A-11006	作为二抗用于确认 C3b/iC3b 包被
UltraVIEW Vox 3D 活细胞成像系统	Perkin Elmer, Rodgau, Germany		转盘共聚焦显微镜系统
Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜	Nikon, Japan		倒置显微镜
CSU-X1 转盘扫描仪	Yokogawa Electric Corporation, Japan		Nipkow 转盘单元
14 位 Hamamatsu C9100-50 电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）帕尔贴冷却相机	Hamamatsu Photonics Inc., Japan		转盘共聚焦显微镜系统的 EM-CCD 相机
488 nm 固态激光器，50 mW	Perkin Elmer, Rodgau, Germany		转盘共聚焦显微镜系统的 488 nm 激光光源
561 nm 固态激光器，50 mW	Perkin Elmer, Rodgau, Germany		转盘共聚焦显微镜系统的 561 nm 激光光源