实时成像巨噬细胞对IgG调理红细胞的吞噬作用

摘要

来源：Horsthemke, M.，等。小鼠巨噬细胞吞噬作用的延时三维成像。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种用于监测巨噬细胞介导的红细胞（RBC）吞噬作用独立事件的实验方法。将经小鼠免疫球蛋白G（IgG）包被的人源红细胞与小鼠巨噬细胞共孵育，并在共聚焦显微镜下观察。红细胞被巨噬细胞吞噬 通过 吞噬杯的形成并被靶向溶酶体降解。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 在通道载玻片中接种腹膜细胞

1. 用移液枪将小鼠腹腔巨噬细胞悬浮液反复吹打以减少细胞团块后，取100 µL细胞悬液加入已预装100 µL液体的纤连蛋白包被的通道载玻片的通道中（100 µL通道的尺寸为：长 × 宽 × 高 = 50 mm × 5 mm × 0.4 mm）。
   1. 通过向通道载玻片的两个储液槽之一加入1 mL含血清的RPMI 1640（Hepes）培养基，倾斜载玻片，然后从下游储液槽中吸出培养基，以预填充腔室 （图1）.
      1. 通过向两个储液池中的其中一个加入1–2 mL培养基，盖紧储液池盖，然后有节奏地用拇指按压盖子，必要时倾斜载片，以排出通道内的多余气泡或长条状空气。排尽空气后，在移除盖子前，将未加盖且含有培养基的储液池一端朝下倾斜，以避免空气被重新吸入通道。
2. 将接种有细胞的通道载玻片置于湿润的孵育盒中，在 37 °C 下孵育 2 小时，无需 CO₂ (CO₂ 由于HCO₃-/CO₂ 缓冲体系被替换为HEPES）。通道式载玻片可方便地放置在可容纳八张载玻片的支架上。通常每只小鼠....

结果

图 1：纤维连接蛋白包被通道载玻片的操作。（A）通道载玻片由两个储液池通过一个尺寸为 50 mm × 5 mm × 0.4 mm 的通道连接而成。通道载玻片最初通过向其中一个储液池加入 1–2 mL 培养基并倾斜载玻片进行预填充。（B）可在孵育前将盖帽安装到储液池上。盖帽可方便地用于在向通道接种细胞前排出不需要的气泡。（C）可通过直接将培养基移液至通道口，填充无气泡的 100 µL 通道。此步骤可用于例如将巨噬细胞接种到载玻片中，或加入荧光素（绿色荧光）标记的抗 F4/80 抗体，后者既作为膜标记物，也作为小鼠巨噬细胞标志物。（D）将颗粒（如调理化的人红细胞）移液至已接种荧光染色巨噬细胞的通道后，可将载玻片置于倒置显微镜载物台上，进行延时旋转盘共聚焦显微成像

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 G 塑料导管	B Braun Mesungen AG, Germany	4254503-01	用于腹腔灌洗
不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 Hank's 平衡盐溶液	Thermo Fisher Scientific	14170120	用于腹腔灌洗
14 mL 聚丙烯圆底管	BD Falcon	352059	用于收集腹腔细胞
含 20 mM Hepes 的 RPMI 1640 培养基	Sigma-Aldrich	R7388	实验基础培养基
热灭活胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10082139	用作 RPMI 1640 培养基的补充物
100 倍青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	用作 RPMI 1640 培养基的补充物
纤维连接蛋白包被的 µ-Slide I 型腔室载片	Ibidi, Martinsried, Germany	80102	用于实验的通道式载片
µ-Slide（阳极氧化铝）支架	Ibidi, Martinsried, Germany	80003	可高压灭菌的可堆叠通道载片支架
含碳酸氢盐的 RPMI 1640 培养基	Sigma-Aldrich	R8758	用于过夜培养的培养基
N-(2-巯基丙酰基)甘氨酸	Sigma-Aldrich	M6635	活性氧清除剂
Alexa Fluor 488 标记的大鼠（IgG2a）单克隆（克隆 BM8）抗小鼠 F4/80 抗体	Thermo Fisher Scientific	MF48020	小鼠巨噬细胞标志物及质膜标记
CellMask Orange	Thermo Fisher Scientific	C10045	红色荧光质膜染料
pHrodo 的琥珀酰亚胺酯	Thermo Fisher Scientific	P36600	pHrodo 的胺反应性琥珀酰亚胺酯
小鼠（IgG2b）单克隆（克隆 HIR2）抗人 CD235a 抗体	Thermo Fisher Scientific	MA1-20893	用于用人 IgG 包被人红细胞
Alexa Fluor 594 标记的山羊抗小鼠（二抗）IgG 抗体	Abcam	Ab150116	用于确认人红细胞被小鼠 IgG 包被
大鼠抗小鼠 C3b/iC3b/C3c 抗体	Hycult Biotech	HM1065	用于确认人红细胞被 C3b/iC3b 包被
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗大鼠 IgG 抗体	Thermo Fisher Scientific	A-11006	作为二抗用于确认 C3b/iC3b 包被
UltraVIEW Vox 3D 活细胞成像系统	Perkin Elmer, Rodgau, Germany		转盘共聚焦显微镜系统
Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜	Nikon, Japan		倒置显微镜
CSU-X1 转盘扫描仪	Yokogawa Electric Corporation, Japan		Nipkow 转盘单元
14 位 Hamamatsu C9100-50 电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）帕尔贴冷却相机	Hamamatsu Photonics Inc., Japan		转盘共聚焦显微镜系统的 EM-CCD 相机
488 nm 固态激光器，50 mW	Perkin Elmer, Rodgau, Germany		转盘共聚焦显微镜系统的 488 nm 激光光源
561 nm 固态激光器，50 mW	Perkin Elmer, Rodgau, Germany		转盘共聚焦显微镜系统的 561 nm 激光光源