钙黄绿素乙酰甲酯染色法评估自然杀伤细胞对癌细胞的细胞毒作用

摘要

来源：Chava, S. 等，在肝肿瘤细胞背景下自然杀伤细胞介导的细胞毒性和迁移能力的测定。视觉化实验杂志 (2020)

本视频展示了一种利用Calcein AM染色法测定自然杀伤细胞对癌细胞细胞毒性的实验方法。自然杀伤细胞与癌细胞共培养后，荧光标记的癌细胞数量减少，表明自然杀伤细胞对癌细胞具有介导的细胞毒性作用。

方案

1. 基于钙黄绿素AM染色的显微镜法检测自然杀伤细胞介导的细胞毒性

1. 将 SK-HEP-1 细胞培养至 70−80% 汇合度。先用 5 mL 1× PBS 洗涤细胞，再加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液孵育，制备单细胞悬液。
2. 将 SK-HEP-1 细胞在 1 mL 无菌离心管中以 160 × g 离心 3 分钟。将沉淀重悬于 3 mL 无血清 DMEM 培养基中。
3. 向 SK-HEP-1 细胞中加入 1.5 µL 钙黄绿素 AM 溶液（10 mM），室温孵育 30 分钟。将标记钙黄绿素 AM 的 SK-HEP-1 细胞在 15 mL 无菌离心管中以 160 × g 离心 3 分钟。
4. 用 5 mL 1× PBS 洗涤细胞两次，以去除多余的钙黄绿素 AM 染料。
5. 同时，将 NK92MI 细胞在 15 mL 无菌离心管中以 160 × g 离心 3 分钟。用 5 mL 1× PBS 洗涤细胞沉淀一次，并重悬于 5 mL NK92MI 细胞培养基中。
6. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对钙黄绿素 AM 标记的 SK-HEP-1 细胞和 NK92MI 细胞进行计数。
7. 将 SK-HEP-1 细胞重悬于培养基中，浓度为 1 × 10⁵ 个细胞/mL；将 NK92MI 细胞重悬于 NK 细胞培养基中，浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL。
8. 在 96 孔板中，每孔加入 100 µL 混合液，包含钙黄绿素 AM 标记的 SK-HEP-1 细胞（靶细胞）（1 × 10⁴ 个/100 µL/孔）和 NK92MI 细胞（效应细胞）（1 × 10⁵ 个/100 µL/孔），靶细胞与效应细胞比例为 1:10，每个处理组设三个复孔。
9. 将 96 孔板置于 37 °C、95% 空气和 5% CO₂ 的培养箱中孵育 4 小时。孵育结束后，使用荧光显微镜在 10 倍放大下拍摄钙黄绿素 AM 标记细胞的荧光图像。每种处理条件的每个重复至少拍摄 10 个不同的视野。
10. 为每个重复随机选取 10 张图像，计数与或不与 NK92MI 细胞共孵育的钙黄绿素 AM 阳性标记靶细胞数量。使用以下公式计算细胞毒百分比。
    
    注意： 作为对照，应设置不含 NK92MI 细胞的靶细胞组，以及完全裂解的靶细胞组作为完全裂解对照。完全裂解对照的制备方法：将细胞在含 0.5% Triton X-100 的溶液中孵育 1 小时（在 200 µL 培养基中加入 20 µL 5% Triton X-100）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Calcein AM 染料	Sigma-Aldrich	17783
DMEM	Gibco	11965-092
胎牛血清	Gibco	26140079
马血清	Gibco	16050114
NK92MI 细胞	ATCC	CRL-2408
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
SKHEP-1 细胞	ATCC	HTB-52
胰蛋白酶 EDTA 溶液	Gibco	25200056