自然杀伤细胞在趋化刺激下迁移能力的测定

摘要

来源：Chava, S.，等。肝肿瘤细胞背景下自然杀伤细胞介导的细胞毒性和迁移能力的测定。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种利用多孔膜插入系统研究自然杀伤（NK）细胞在趋化因子作用下迁移的方法。该方法可借助流式细胞术对NK细胞的迁移进行定量分析。

方案

1. 自然杀伤细胞迁移实验

1. 培养 NK92MI 细胞，并在 15 mL 无菌离心管中以 160 × g 离心 3 分钟。
2. 用 5 mL 1× PBS 洗涤细胞沉淀两次，然后将细胞重悬于 3 mL 无血清的 NK92MI 细胞培养基中。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对 NK92MI 细胞进行计数。
3. 将 NK92MI 细胞以每孔 100 µL 含 2.5 × 10⁵ 个细胞的密度接种至 Transwell 小室的上室（插入式滤膜直径为 6.5 mm，孔径为 5 µm）。
4. 在下室中加入 0.6 mL 含有待测物质（例如条件培养基、趋化因子或细胞因子）的无血清培养基，用于检测其对 NK 细胞的趋化活性。
   注意： 制备条件培养基时，应使用减血清培养基且不额外添加血清，以避免血清蛋白对迁移实验造成干扰。
5. 将 24 孔 Transwell 小室在 37°C 培养 4 小时。4 小时后，收集下室中未贴壁并已迁移的 NK92MI 细胞，转移至荧光激活细胞分选（FACS）管中用于后续分析。
   注意： 培养时间可能因靶细胞类型以及靶细胞产生趋化因子的种类、浓度和动力学而异。因此，该时间应根据每种细胞类型、趋化因子和具体实验条件通过实验经验确定。
6. 向每管含迁移 NK 细胞的样品中加入 50 µL 含预定数量的流式细胞术计数微球。使用具备自动基于 FACS 的细胞计数功能的任意流式细胞仪，检测每孔 300 µL 的细胞悬液。
   注意： 每次使用前均需充分混匀或涡旋混匀流式细胞术计数微球，以确保每次使用微球数量一致，从而减少实验变异。建议采用反向移液法操作计数微球以保持准确性。仅使用 NK 细胞和计数微球作为流式细胞术 FACS 分析的对照。作者建议至少检测 10,000 个微球与 NK 细胞的总数量，该数值在实践中效果良好。然而，具体数值可能因实验条件不同而有所变化。因此，微球与 NK 细胞的总数应根据每类实验经验确定。此外，为获得具有统计学意义的结果并控制不同细胞计数间的变异，必须进行生物学重复实验（至少三重复）。
7. 使用以下公式计算迁移的 NK92MI 细胞的绝对数量：
   
   其中 A = 细胞数量，B = 微球数量，C = 该批次微球标示的计数（即每 50 µL 流式细胞术计数微球的数量；本例中为 49,500），D = 样品体积（µL）。
   注意： 若 FACS 分析时使用 300 µL 样品体积（迁移细胞）和 50 µL 流式细胞术计数微球，则迁移细胞的绝对数量 = 1,700 个细胞 / 3,300 个微球事件 × 49,500 个微球 / 300 µL = 84.975 个细胞/µL。若样品被稀释或使用了不同体积的 FACS 计数微球，则需对计算结果进行相应校正。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
绝对计数微球	Thermo Fisher Scientific	C36950
NK92MI 细胞	ATCC	CRL-2408
SKHEP-1 细胞	ATCC	HTB-52
Transwell 可穿透小室	Costar	3241
Opti-MEM	Gibco	31985070
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	P4417
Alpha-MEM	Sigma-Aldrich	M4256