一种用于检测抗体补体介导杀菌活性的血清杀菌试验

摘要

来源：Weerts, H. P., 等 一种高通量的志贺氏菌特异性杀菌检测方法。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种用于评估血清中抗体介导的补体依赖性杀菌活性的技术。该方法将分离的血清与致病菌及外源性补体蛋白混合。经过孵育后，将细菌接种于琼脂平板上培养，并通过定量生成的菌落来测定血清的杀菌滴度。

方案

1. 准备补体和靶向细菌

1. 准备幼兔补体（BRC）
   注意：补体批次选择的详细标准请参见：https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
   1. 取冻存的BRC，用流动的冷水解冻。每约10-20分钟手动混匀一次，直至完全解冻。避免对BRC进行反复冻融。
   2. 在BRC解冻过程中，标记1.5 mL、5 mL或15 mL离心管，并将标记好的管子置于冰上预冷。将适当体积的BRC分装至预冷的离心管中（加样后立即放回冰上）。将分装后的BRC储存于≤ -70 °C的冰箱中。
      注意：每块检测板大约需要1 mL补体。补体分装物仅供一次性使用，应根据实验设计的布局分装成合适的体积。
   3. 制备热灭活BRC时，先解冻一份有活性的BRC分装物。准备一个56 °C水浴。待BRC完全解冻后，将其转移至水浴中，孵育30分钟。
   4. 孵育结束后，将热灭活的BRC从水浴中取出，在室温（RT）下冷却10-15分钟。剧烈混匀后，将约150 µL分装至1.5 mL微量离心管中。将分装物储存于≤ -10 °C。
2. 制备靶细菌储备液
   注意：以下步骤用于制备48份靶细菌储备液；如需更多分装量，可按比例放大操作....

结果

图 1：显色后的 LBA 平板。 典型的 S. flexneri 3a 细菌微菌落在过夜培养后已生长至适当大小。已覆盖上层琼脂，菌落通过上层琼脂中的 TTC 化合物还原而呈现红色。

图2：美国国家标准与.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
明胶	Sigma	G9391	B型，粉末，BioReagent，适用于细胞培养
TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）	Sigma	T8877	≥98.0%（HPLC）
叠氮化钠（NaN3）	Sigma	S2002	≥99.5%
幼兔补体	PelFreez	31061-3	3–4 周龄
含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS	Invitrogen	14065-56	不含酚红
LB 琼脂（Lennox）	Sigma	L2897	粉末状微生物培养基
Bacto 琼脂	BD	214010	粉末状，(C12H18O9)n
甘油	Sigma	G5516	分子生物学级，≥99%
LB 肉汤（Lennox）	Sigma	L3022	粉末状微生物培养基
方形培养皿	Sigma	Z617679-240EA	120 mm × 120 mm
检测板	Costar	3799	96 孔圆底板，带盖
NICE 软件	阿拉巴马大学伯明翰分校		ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/