一种用于检测抗体补体介导杀菌活性的血清杀菌试验

摘要

来源：Weerts, H. P., 等 一种高通量的志贺氏菌特异性杀菌检测方法。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种用于评估血清中抗体介导的补体依赖性杀菌活性的技术。该方法将分离的血清与致病菌及外源性补体蛋白混合。经过孵育后，将细菌接种于琼脂平板上培养，并通过定量生成的菌落来测定血清的杀菌滴度。

方案

1. 准备补体和靶向细菌

1. 准备幼兔补体（BRC）
   注意：补体批次选择的详细标准请参见：https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
   1. 取冻存的BRC，用流动的冷水解冻。每约10-20分钟手动混匀一次，直至完全解冻。避免对BRC进行反复冻融。
   2. 在BRC解冻过程中，标记1.5 mL、5 mL或15 mL离心管，并将标记好的管子置于冰上预冷。将适当体积的BRC分装至预冷的离心管中（加样后立即放回冰上）。将分装后的BRC储存于≤ -70 °C的冰箱中。
      注意：每块检测板大约需要1 mL补体。补体分装物仅供一次性使用，应根据实验设计的布局分装成合适的体积。
   3. 制备热灭活BRC时，先解冻一份有活性的BRC分装物。准备一个56 °C水浴。待BRC完全解冻后，将其转移至水浴中，孵育30分钟。
   4. 孵育结束后，将热灭活的BRC从水浴中取出，在室温（RT）下冷却10-15分钟。剧烈混匀后，将约150 µL分装至1.5 mL微量离心管中。将分装物储存于≤ -10 °C。
2. 制备靶细菌储备液
   注意：以下步骤用于制备48份靶细菌储备液；如需更多分装量，可按比例放大操作。
   1. 从冰箱中取出细菌主储备管，刮取冷冻菌体表面，将少量冰晶转移至血琼脂平板上。立即将主储备管放回冰箱冷冻保存。
   2. 将此少量细菌储备物划线接种于血琼脂平板上，并盖上平板盖。将平板倒置，在37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养。
   3. 挑取约10个分离良好的光滑菌落，转移至含有30 mL LB肉汤的50 mL离心管中。在37 °C轻度振荡条件下培养3-5小时，直至菌液OD₆₀₀达到约0.6-0.7。
   4. 收集上层12.5 mL培养物，转移至新的50 mL离心管中。使用台式微量离心机在15,000 x g条件下离心2分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于25 mL含15%无菌甘油的LB培养基中。
   5. 充分混匀后，将0.5 mL分装至无菌1.5 mL微量离心管中（约48管）。将分装物储存于≤ -70 °C冰箱中。
   6. 使用凝集试验在使用前确认细菌身份。
3. 确定靶细菌储备液的最佳稀释倍数
   注意：每批靶细菌储备液都必须在实验条件下进行滴定，以确定能够产生约120 CFU/点的稀释度。
   1. 取一块微量滴定板（稀释板），在1A孔中加入135 µL检测缓冲液，在1B–1H孔中各加入120 µL检测缓冲液。
   2. 从冰箱中取出一管冻存的靶细菌，室温解冻。将15 µL解冻后的细菌储备液加入1A孔，使细菌储备液稀释10倍。
   3. 从1A孔中转移30 µL细菌溶液至1B孔，进行5倍系列稀释。继续进行5倍系列稀释至1H孔，共8个稀释梯度（1:10；1:50；1:250；1:1 250；1:6 250；1:31 250；1:156 250；1:781 250）。
   4. 另取一块微量滴定板（检测板），在检测板第1列和第2列的所有孔中加入20 µL检测缓冲液。
   5. 将稀释板第1列各孔中的10 µL稀释后细菌液转移至检测板相应位置的第1列和第2列孔中。例如，将稀释板1A孔中的10 µL细菌液分别加入检测板的1A孔和2A孔，依此类推。
   6. 随后按照下文血清杀菌试验（SBA）中Control A和Control B的步骤3.6–3.12继续操作。
   7. 待平板在冰上孵育后，使用八通道移液器将第1列各孔中的10 µL液体点样至LBA平板上。同样，也将第2列各孔中的液体点样至LBA平板上。
   8. 继续按照下文步骤3.14–4.6进行实验。
   9. 确定在Control B中产生约120 CFU/点的细菌稀释度，该稀释度将用于正式实验。

2. 血清杀菌试验（SBA）

注意： 下述步骤适用于一块检测板，但可增加检测板的数量。

1. 将样本置于56 °C水浴中孵育30分钟，以进行热灭活处理。
   注意： 测试样本在检测前必须经过热灭活，以消除任何内源性补体活性。此步骤可在检测前完成，灭活后的样本可重新冷冻或在4 °C保存至检测时使用。
2. 取一块检测板，向 A 至 G 行的第 1 至 12 列每孔加入 20 µL 检测缓冲液。向 H 行的第 1 和第 2 列每孔加入 20 µL 检测缓冲液，参见 表1.
3. 将每种测试样品各30 µL重复加样至检测板的H行。例如，将30 µL样品1加入孔3H和4H，将30 µL样品2加入孔5H和6H，依此类推。
4. 使用多通道移液器对测试样品进行3倍系列稀释。​
   1. 从第3H至12H孔中各取出10 µL样品，转移至G行相应孔中，并用移液器上下吹打8–10次，充分混匀样品。
   2. 然后从3G-12G孔中各移除10 µl，转移至F行对应孔中，并充分混匀。
   3. 将这些系列稀释继续至A行。混合A行各孔后，从3A至12A孔中分别移除并弃去10 µl，使所有孔中液体体积均为20 µl。
      注意： 由于在总体积为80 µL的检测体系中使用了20 µL血清，因此检测中存在4倍的额外稀释。在计算SBA滴度时，必须将血清稀释倍数乘以4以校正该稀释效应。例如，若起始稀释倍数为1:2，则实际检测的稀释倍数为1:8。
5. 取出一管冷冻的靶细菌储备液，在室温下解冻。根据预先确定的最佳稀释倍数，将细菌悬浮液在20 mL检测缓冲液中进行稀释（该稀释倍数已在第部分中确定） 1.3使用多通道移液器，向检测板的每个孔中加入10 µL稀释后的细菌。
6. 取出一管冻存的BRC和一管冻存的热灭活BRC，在室温下用流动的冷水解冻，或将冻存管置于生物安全柜的格栅上，利用吹风加速解冻。
7. 配制20%的热灭活BRC溶液。将100 µL热灭活BRC与400 µL检测缓冲液混合。向第1列所有孔（对照A孔）中各加入50 µL该20%热灭活BRC溶液。
   注意： 热灭活的BRC用作对照，以监测实验中的非特异性杀伤（NSK）。
8. 配制20%的天然BRC溶液。将1 mL天然BRC与4 mL测定缓冲液混合。取50 µL该混合液加入第2至第12列的所有孔中（对照B孔和待测样品孔）。
   注意： 反应混合物中BRC的最终浓度为12.5%。
9. 轻轻振荡酶标板10-15秒，或使用多通道移液器上下吹打8次，以充分混匀。
10. 将检测板放入37 °C的微生物培养箱中孵育2小时（不振荡）。
11. 将2 LBA平板开盖后倒置于生物安全柜中干燥40–60分钟。
12. 2小时孵育结束后，将检测板转移至湿冰上，孵育10–20分钟以终止反应。
13. 使用12通道移液器混匀H行各孔，取10 µL反应混合物点样至LBA板底部。立即倾斜LBA板，使样点向下迁移约1.5–2 cm。按相同方法依次对G、F和E行进行操作，将样点点于LBA板上先前样点的上方。E、F、G和H行点样于第一张LBA板，A、B、C和D行以相同方式点样于第二张LBA板，参见 图1.
14. 将LBA平板在室温下孵育，直至溶液被LBA平板吸收（10–15分钟）。盖上LBA平板的盖子，并将平板倒置放入微生物培养箱中，过夜培养（约16–18小时）。孵育 志贺氏菌 福氏 (Shigella flexneri) 2a 和 3a 在 29 °C 下孵育 S. sonnei 为26 °C。
    注意： 这些温度下形成的“微菌落”尺寸较小，适合使用菌落计数器进行准确计数9。
15. 过夜培养后，加入25 mL含100 µg/mL TTC和0.1% NaN₃的覆盖琼脂（约55 °C）₃ 到每个LBA平板中。
16. 在37 °C下孵育LBA平板2小时，使存活的细菌呈现红色，参见 图1 如下。
17. 使用数码相机拍摄培养皿照片，并将图像传输至已安装美国国家标准与技术研究院综合菌落计数软件（NICE）的计算机，参见 图2.
    注意： NICE 菌落计数软件免费提供。参见 材料清单 有关详细信息和安装说明。

表1：检测板布局。 第1列和第2列包含补体对照孔。对照A位于第1列，为热灭活补体对照，含有SBA缓冲液、细菌和热灭活补体。对照B位于第2列，为活性补体对照，含有SBA缓冲液、细菌和补体。第3至12列包含血清样本。每个样本设两个复孔，从H行到A行进行3倍系列稀释。

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

对照 A

对照 B

稀释液 8

稀释液 8

稀释液 8

稀释液 8

稀释液 8

稀释液 8

稀释液 8

稀释液 8

稀释液 8

稀释液 8

B

对照 A

对照 B

稀释液 7

稀释液 7

稀释液 7

稀释液 7

稀释液 7

稀释液 7

稀释液 7

稀释液 7

稀释液 7

稀释液 7

C

对照 A

对照 B

稀释液 6

稀释液 6

稀释液 6

稀释液 6

稀释液 6

稀释液 6

稀释液 6

稀释液 6

稀释液 6

稀释液 6

D

对照 A

对照 B

稀释液 5

稀释液 5

稀释液 5

稀释液 5

稀释液 5

稀释液 5

稀释液 5

稀释液 5

稀释液 5

稀释液 5

E

对照 A

对照 B

稀释液 4

稀释液 4

稀释液 4

稀释液 4

稀释液 4

稀释液 4

稀释液 4

稀释液 4

稀释液 4

稀释液 4

F

对照 A

对照 B

稀释液 3

稀释液 3

稀释液 3

稀释液 3

稀释液 3

稀释液 3

稀释液 3

稀释液 3

稀释液 3

稀释液 3

G

对照 A

对照 B

稀释液 2

稀释液 2

稀释液 2

稀释液 2

稀释液 2

稀释液 2

稀释液 2

稀释液 2

稀释液 2

稀释液 2

H

对照 A

对照 B

稀释液 1

稀释液 1

稀释液 1

稀释液 1

稀释液 1

稀释液 1

稀释液 1

稀释液 1

稀释液 1

稀释液 1

样品 1

样品 2

样品 3

样品 4

样品 5

结果

图 1：显色后的 LBA 平板。 典型的 S. flexneri 3a 细菌微菌落在过夜培养后已生长至适当大小。已覆盖上层琼脂，菌落通过上层琼脂中的 TTC 化合物还原而呈现红色。

图2：美国国家标准与...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
明胶	Sigma	G9391	B型，粉末，BioReagent，适用于细胞培养
TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）	Sigma	T8877	≥98.0%（HPLC）
叠氮化钠（NaN3）	Sigma	S2002	≥99.5%
幼兔补体	PelFreez	31061-3	3–4 周龄
含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS	Invitrogen	14065-56	不含酚红
LB 琼脂（Lennox）	Sigma	L2897	粉末状微生物培养基
Bacto 琼脂	BD	214010	粉末状，(C12H18O9)n
甘油	Sigma	G5516	分子生物学级，≥99%
LB 肉汤（Lennox）	Sigma	L3022	粉末状微生物培养基
方形培养皿	Sigma	Z617679-240EA	120 mm × 120 mm
检测板	Costar	3799	96 孔圆底板，带盖
NICE 软件	阿拉巴马大学伯明翰分校		ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/