补体介导的抗体杀菌活性的血清杀菌测定

Abstract

来源:Weerts， H. P. 等人 A 高通量志贺氏菌特异性杀菌测定。J. Vis. Exp. （2019 年）。

该视频演示了一种评估血清中存在的抗体的补体介导的杀菌活性的技术。这种方法将分离的血清与病原菌和外源性补体蛋白相结合。孵育后，细菌在琼脂平板上生长，并定量产生的菌落以测量血清杀菌滴度。

Protocol

1. 准备补体和目标细菌

1. 准备小兔补体 （BRC）
   注:补充批次选择的详细标准可在此处找到:https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
   1. 获得冷冻的 BRC 并用流动的冷水解冻。每 ~10-20 分钟物理混合一次 BRC，直到完全解冻。不要让 BRC 反复冻融循环。
   2. BRC 解冻时，标记 1.5 mL、5 mL 或 15 mL 离心管。将标记的试管放在冰上预冷。将适当体积的 BRC 分装到预冷的离心管中（填充后，立即将每个管放回冰中）。将等分试样储存在 ≤ -70 °C 的冰箱中><。 注意: 每个检测板大约需要 1 mL 的补体。补体等分试样为一次性使用，应按适合检测布局的体积分装。
   3. 要制备热灭活 BRC，请解冻一份活性 BRC 等分试样。准备 56 °C 水浴。BRC 完全解冻后，将其转移到水浴中并孵育 30 分钟。
   4. 孵育后，从水浴中取出热灭活的 BRC，并在室温 （RT） 下冷却 10-15 分钟。剧烈混合，并将 ~150 μL 分装至 1.5 mL 微量离心管中。将等分试样储存在 ≤ -10 °C。
2. 准备目标细菌原液
   注意:以下程序用于制备 48 等分试样的目标细菌原液;如果需要更多等分试样，可以放大实验方案。
   1. 从冰箱中取出细菌预液小瓶，刮擦冷冻的细菌表面，将小瓶中的少量冰除到血琼脂板上。立即将原液样品瓶放回冰箱。
   将
   2. 这一小份细菌原液划线到血琼脂板上，并用板盖盖住。将板倒置在 37 °C/5% CO₂ 培养箱中孵育过夜。
   3. 将 ~10 个分离的光滑菌落转移到含有 30 mL LB 肉汤的 50 mL 试管中。在 37 °C 下轻轻摇动孵育 3-5 小时，直到培养液的 OD₆₀₀ 为 ~0.6-0.7。
   4. 收获培养物的顶部 12.5 mL，并转移到新的 50 mL 试管中。使用台式微量离心机将培养物以 15,000 x g 离心 2 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 25 mL 的 15% 无菌甘油-LB 中。
   5. 充分混合，将 0.5 mL 等分试样分配到无菌 1.5 mL 微量离心管（~48 管）中。将等分试样储存在 ≤ -70 °C 的冰箱中。
   6. 使用前使用凝集试验确认细菌身份。
3. 确定目标细菌库存的最佳稀释因子
   注:每批目标细菌原液必须在测定条件下滴定，以确定在 LB 板上产生 ~120 CFU/点所需的稀释度。
   1. 获取微量滴定板（稀释板），向 1A 孔中加入 135 μL 检测缓冲液。向 1B-1H 孔中加入 120 μL 检测黄油。
   2. 从冰箱中取出一小瓶冷冻目标细菌，并在室温下解冻。将 15 ul 解冻的细菌原液添加到 1A 孔中，使细菌原液稀释 10 倍。
   3. 将 30 μL 细菌溶液从 1A 孔转移到 1B 孔中，进行 5 倍连续稀释。继续对 1H 孔进行 5 倍连续稀释，总共稀释 8 次（1:10、1:50、1:250、1:1 250、1:6 250、1:31 250、1:156 250、1:781 250）。
   4. 获取另一个微量滴定板（检测板），向检测板第 1 列和第 2 列的所有孔中加入 20 μL 检测缓冲液。
   5. 将 10 μL 稀释的细菌从稀释板第 1 列的每个孔中转移到检测板第 1 列和第 2 列的相应孔中。将 10 μL 细菌从稀释板的 1A 孔转移到检测板的 1A 和 2A 孔中，依此类推。
   6. 按照下面对照 A 和对照 B 的血清杀菌测定 （SBA） 中的说明继续进行测定，步骤 3.6-3.12。
   7. 将板在冰上孵育后，使用带有 8 个移液器吸头的多通道移液器将 10 μL 从第 1 列的孔中点样到 LBA 板上。此外，将第 2 列的孔点到 LBA 板上。
   8. 按照下面的步骤 3.14-4.6 中的说明继续进行测定。
   9. 确定在对照 B 中产生 ~120 CFU/点的细菌稀释度，该稀释度将用于测定。

2. 血清杀菌测定 （SBA）

注意:以下描述的程序适用于一个检测板，但检测板的数量可以增加。

1. 通过在 56 °C 水浴中孵育样品 30 min.
   来对测试样品进行热灭活 注意:测试样品必须在测试前进行热灭活，以消除任何内源性补体活性。这可以在检测之前完成，灭活样品可以重新冷冻或储存在 4 °C 直至检测。
2. 获取检测板，向 A 行至 G 行的第 1 列至第 12 列添加 20 μL 检测缓冲液。向 H 行的第 1 列和第 2 列添加 20 μL 检测缓冲液，见表 1。
3. 将 30 μL 每个测试样品一式两份加载到检测板的 H 行。例如，将 30 μL 样品 1 分配到 3H 和 4H 孔中，将 30 μL 样品 2 分配到 5H 和 6H 孔中，以此类推。
4. 使用多通道移液器对测试样品进行 3 倍连续稀释。​
   1. 从 3H-12H 孔中取出 10 μ样品，转移到 G 行的相应孔中，上下吹打 8-10 次，将样品充分混合。
   2. 然后从 3G-12G 孔中取出 10 μ，转移到 F 行的相应孔中并充分混合。
   3. 通过 A 行继续这些连续稀释。在 A 行混合孔后，从 3A-12A 孔中取出并丢弃 10 μl><，以便所有孔都含有 20 μl。 注意:由于在 80 μL 的总检测体积中使用了 20 μL 血清，因此检测中增加了 4 倍的稀释度。在计算 SBA 滴度时，必须通过将血清稀释度乘以 4 来考虑这种稀释度。例如，如果使用 1:2 的起始稀释度，则测试的实际稀释度为 1:8。
5. 取出一小瓶冷冻目标细菌原液，并在室温下解冻。根据预先确定的最佳稀释因子，在 20 mL 检测缓冲液中稀释细菌（该稀释因子在第 1.3 节中确定）。使用多通道移液器向检测板的每个孔中加入 10 μL 稀释的细菌。
6. 取出一小瓶冷冻的 BRC 和一小瓶冷冻的热灭活 BRC，在室温下用流动的冷水解冻，或放在生物安全柜的炉排上，用吹风快速解冻。
7. 准备 20% 的热灭活 BRC 溶液。将 100 μL 热灭活的 BRC 与 400 μL 检测缓冲液混合。将 50 μL 这种 20% 热灭活的 BRC 溶液添加到第 1 列（对照 A 孔）中的所有孔中><。 注意:热灭活的 BRC 用作对照来监测测定中的非特异性杀伤 （NSK）。
8. 制备 20% 的天然 BRC 溶液。将 1 mL 天然 BRC 与 4 mL 检测缓冲液混合。向第 2 列至第 12 列（对照 B 和测试样品孔）的所有孔中加入 50 μL 此混合物><。 注意: 反应混合物中 BRC 的最终浓度为 12.5%。
9. 通过在板振荡器上轻轻摇动 10-15 秒来短暂混合检测板，或使用多通道移液器上下吹打 8 次来混合。
10. 将检测板放入 37 °C 微生物培养箱中 2 小时（不摇晃）。
11. 取下盖子并将板面朝上放入生物安全柜中 40-60 分钟，干燥 2 个 LBA 板。
12. 孵育 2 小时后，将检测板移至湿冰上并孵育 10-20 分钟以终止反应。
13. 使用 12 通道移液器，混合 H 行中的孔，并将 10 μL 反应混合物点到 LBA 板底部。立即倾斜板，让斑点流淌 ~1.5-2 厘米。对 G、F 和 E 行重复此过程，将它们放在 LBA 板上前一行的上方。E、F、G 和 H 行以相同的方式点样显示在第二个 LBA 板上，A、B、C 和 D 行以相同的方式点样显示在第二个 LBA 板上，见图 1。
14. 在室温下孵育 LBA 板，直到溶液吸附到 LBA 板中（10-15 分钟）。盖上 LBA 板的盖子，将 LBA 板倒置放入微生物培养箱中孵育过夜（~16-18 小时）。在 29 °C 下孵育福氏志贺氏菌 2a 和 3a，并在 26 °C 下孵育 S. sonnei is><。 注意:这些温度会产生更小的"微菌落"，其大小适合菌落计数器进行准确计数9。
15. 孵育过夜后，向每个 LBA 板中加入 25 mL 含有 100 μg/mL TTC 和 0.1% NaN₃ 的覆盖琼脂（在 ~55 °C）。
16. 将LBA板在37°C下孵育2小时，以使存活的细菌形成红色，请参见下面的图1。
17. 使用数码相机拍摄印版并将图像传输到安装了 NIST 集成菌落计数软件 （NICE） 的计算机，参见图 2.
    注意:NICE 菌落计数软件免费提供。有关详细信息和安装说明，请参阅材料列表。

表 1:检测板布局。第 1 列和第 2 列包含补体对照孔。对照 A 位于第 1 列中，是热灭活补体对照，包含 SBA 缓冲液、细菌和热灭活补体。对照 B 位于第 2 列，是活性补体对照，含有 SBA 缓冲液、细菌和补体。第 3-12 列包含血清样品。每个样品一式两份运行，并从 H 行到 A 行连续稀释 3 倍

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 1 阿拉伯数字 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 一个 控件 A 控件 B 稀释度 8 稀释度 8 稀释度 8 稀释度 8 稀释度 8 稀释度 8 稀释度 8 稀释度 8 稀释度 8 稀释度 8 乙 控件 A 控件 B 稀释度 7 稀释度 7 稀释度 7 稀释度 7 稀释度 7 稀释度 7 稀释度 7 稀释度 7 稀释度 7 稀释度 7 丙 控件 A 控件 B 稀释度 6 稀释度 6 稀释度 6 稀释度 6 稀释度 6 稀释度 6 稀释度 6 稀释度 6 稀释度 6 稀释度 6 D 控件 A 控件 B 稀释度 5 稀释度 5 稀释度 5 稀释度 5 稀释度 5 稀释度 5 稀释度 5 稀释度 5 稀释度 5 稀释度 5 E 控件 A 控件 B 稀释度 4 稀释度 4 稀释度 4 稀释度 4 稀释度 4 稀释度 4 稀释度 4 稀释度 4 稀释度 4 稀释度 4 F 控件 A 控件 B 稀释 3 稀释 3 稀释 3 稀释 3 稀释 3 稀释 3 稀释 3 稀释 3 稀释 3 稀释 3 克 控件 A 控件 B 稀释 2 稀释 2 稀释 2 稀释 2 稀释 2 稀释 2 稀释 2 稀释 2 稀释 2 稀释 2 H 控件 A 控件 B 稀释度 1 稀释度 1 稀释度 1 稀释度 1 稀释度 1 稀释度 1 稀释度 1 稀释度 1 稀释度 1 稀释度 1 示例 1 示例 2 示例 3 示例 4 示例 5

Results

图 1:显色后的 LBA 板。代表性 S. flexneri 3a 细菌微菌落在一夜之间生长到合适的大小。添加了覆盖琼脂，并且通过还原覆盖琼脂中的 TTC 化合物，菌落已形成红色。

图 2:NIST 的集成菌落枚举器 （NICE） 软件界面。 NICE 软件界面的图形表示。在计数之前，感兴趣区域 （ROI） 以每个点的菌落为中心。可以直接从 NICE 窗口导出数据。

Materials