腹腔巨噬细胞对凋亡胸腺细胞吞噬作用的分析

摘要

来源：Zhen, Y. 等，巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的实验分析。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了通过荧光显微镜分析腹腔巨噬细胞介导的小鼠胸腺细胞凋亡清除作用的实验步骤。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. CFSE标记的凋亡胸腺细胞的制备

1. 通过吸入 CO₂ 10 分钟处死两只未经处理的 C57/B6 小鼠，解剖以打开胸腔，用弯头精细镊子将胸腺取出（拉出）至含有 10 mL RPMI1640 培养基的组织培养培养皿中。
2. 将整个胸腺在两张磨砂端的显微镜载玻片之间研磨，获得单细胞悬液，然后通过 100 μm 细胞筛过滤悬液。
3. 将 10 mL 胸腺悬液收集至 50 mL 离心管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
4. 弃去上清液，用 40 mL 1× PBS 重悬，使用血细胞计数板计数细胞数量。
5. 在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
6. 在 50 mL 离心管中用 20 mL 1× PBS 重悬为单细胞悬液，细胞数量最多为 2 × 10⁸ 个（若超过 2 × 10⁸ 个细胞，则将剩余细胞用另一 50 mL 离心管中的 20 mL 1× PBS 重悬）。
7. 在另一个 50 mL 离心管中，将 40 μL CFSE 储存液（2.5 mM）加入 20 mL 1× PBS 中，配制成等体积（20 mL）的 5 μM CFSE 溶液，并通过倒置混匀 2–3 次充分混合。
8. 将步骤 1.7 中的 20 mL CFSE 溶液加入步骤 1.6 中的 20 mL 细胞悬液中（此时 CFSE 的终浓度为 2.5 μM）。
   注意：每 20 mL 细胞悬液需准备一个 20 mL CFSE 管。
9. 将细胞与 CFSE 混合液的离心管倒置 2–3 次，于室温避光孵育最多 2 分钟，然后加入 10 mL 热灭活马血清终止反应。
10. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
    注意：若 CFSE 标记成功，细胞沉淀将呈浅黄色。
11. 弃去上清液，用 40 mL 1× PBS 重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数板计数细胞数量。
12. 将细胞悬液在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
13. 用 40 mL RPMI1640 培养基再次洗涤细胞沉淀。
14. 弃去上清液，将细胞以 7 × 10⁶ 个细胞/mL 的浓度重悬于 RPMI1640 组织培养基（RPMI1640、20 mM HEPES、10% FBS（热灭活）、20 mM 谷氨酰胺和 1× 青霉素/链霉素）中，置于 100 mm 组织培养皿中。
    注意：若获得的细胞数量较多，则需使用额外的 100 mm 组织培养皿。
15. 向细胞悬液培养物中加入星形孢菌素（staurosporine），使其终浓度为 1 μM，并在含 5% CO₂ 的组织培养孵箱中于 37 °C 培养 4 小时。

2. 腹腔巨噬细胞的制备

1. 在第0天，对两只C57B6小鼠（或实验室中任何基因改造小鼠）进行腹腔注射，每只注射1 mL 3%的陈化硫代甘油酸盐溶液。
2. 在第5天按照步骤1.1处死小鼠，剪开并剥离腹部皮肤，但保持腹膜完整。使用连接18 G针头的10 mL注射器，将10 mL洗涤缓冲液（RPMI1640，2% FBS，0.04% EDTA）快速推入腹腔，冲洗腹腔。
3. 用同一针头和注射器缓慢回收洗涤液，并将洗涤液收集至50 mL离心管中。
4. 用1×PBS洗涤腹腔灌洗液两次，将腹腔巨噬细胞重悬于RPMI1640培养基中，细胞密度为2 × 10⁶ 个细胞/mL，每孔加入500 μL至24孔板中。将培养板置于组织培养箱中孵育2小时。
5. 通过吸除并更换为500 μL新鲜培养基两次，去除未贴壁的悬浮细胞。
6. 可选：根据图注中指示的浓度，向巨噬细胞培养物的每孔中加入TAM受体酪氨酸激酶抑制剂RXDX-106，并继续孵育2小时。

3. 腹腔巨噬细胞与凋亡胸腺细胞的共培养

1. 从步骤1中收集凋亡胸腺细胞，并用RPMI1640培养基洗涤三次。此时可使用Annexin V/7-AAD试剂盒检测凋亡诱导效率。
2. 根据实验设计，将0–12 × 10⁶ 个细胞（溶于500 μL培养基）加入至方案#2的巨噬细胞培养物各孔中（例如，参见图1）。使每孔总培养体积达到1 mL。在加入凋亡胸腺细胞前，立即向培养物中加入阻断抗体。
3. 将细胞混合物置于含5% CO₂的组织培养孵箱中，37 °C培养4小时。
4. 用含500 μM EDTA的1× PBS洗涤各孔两次，以去除未贴壁的凋亡细胞。
5. 在此阶段对贴壁巨噬细胞进行CD11b-PE染色。
   1. 用染色缓冲液（1× PBS，1% BSA）洗涤贴壁巨噬细胞一次。
   2. 向每孔中加入含有2 μL CD11b-PE的200 μL染色缓冲液。
   3. 将培养板置于4 °C孵育20分钟。
   4. 用染色缓冲液洗涤各孔三次。
   5. 每孔加入200 μL染色缓冲液，随后将培养板置于荧光显微镜下进行图像分析。

结果

图 1. 腹腔巨噬细胞对凋亡胸腺细胞的吞噬百分比。 凋亡胸腺细胞通过在 1 μM 佛波酯（staurosporine）中孵育 4 小时诱导产生，并以如图所示的比例加入巨噬细胞培养物中：(A) 1:0；(B) 1:1；(C) 1:2；(D) 1:4；(E) 1:6；(F) 1:8；(G) 1:10；(H) 1:12。数据由流式细胞仪获取，使用流式细胞仪配套软件分析吞噬性巨噬细胞的百分比。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ack 裂解缓冲液	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer 抗体	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE（克隆 M1/70）	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA（0.5 mM）	GIBCO	15575-020
FACS 管	BD Biosciences	352017
马血清（热灭活）	Invitrogen	26050088
PBS，1×	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
星形孢菌素（100 mg）	Fisher Scientific	BP2541-100	将 100 mg 样品加入 214.3 ml DMSO 中，配制成 1 mM 储存液