巨噬细胞细胞外陷阱的体外刺激和可视化

摘要

来源:Zhang， Y. et al. 分化的人单核细胞衍生巨噬细胞中细胞外陷阱释放的体外刺激和可视化。J. Vis. Exp. （2019 年）。

该视频演示了使用不同的炎症刺激（如 TNF-α、PMA 和 HOCL）对人单核细胞衍生的巨噬细胞衍生巨噬细胞中的巨噬细胞外陷阱 （MET） 的体外刺激。该视频还演示了 MET 的 SYTOX 染料染色方法以进行可视化。

方案

1. HMDM 的极化

1. 在无菌条件下，通过向完整的 RPMI-1640 培养基中添加干扰素γ （IFNγ;20 ng/mL） 和脂多糖 （LPS;1 μg/mL） 来制备 M1 引发培养基。通过将白细胞介素 4 （IL-4;20 ng/mL） 添加到完整的 RPMI-1640 培养基中来制备 M2 引发培养基。
2. 在无菌条件下，从含有人单核细胞衍生的巨噬细胞 HMDM 的组织培养板孔中吸出培养基，这些巨噬细胞已按照第 1 节所述接种和培养。
3. 使用 1 mL 等分试样的 PBS，用无菌 PBS（预热至 37 °C）小心洗涤含有细胞的孔 3 次。
4. 向每个含有 HMDM 的孔中加入 1 mL 的 M1 或 M2 引发培养基（以适合实验的为准）。
5. 将细胞在 37 °C 下，在 5% CO₂ 存在下，在细胞培养箱中孵育 48 小时。

2. 刺激 HMDM 诱导 MET 释放

1. 在无菌条件下，制备含有巨噬细胞细胞外陷阱不同刺激剂的培养基，MET释放（以适合实验者为准）到完整的RPMI-1640培养基中:PMA（25 nM）、人重组 TNFα （25 ng/mL） 或人重组 IL-8 （50 ng/mL）。
2. 对于次氯酸、HOCl 刺激的实验，在加入细胞之前，立即在 HBSS（预热至 37 °C）中制备 HOCl （200 μM）。确保 HOCl 未在完全细胞培养基中制备。
   注意:通过测量溶液在 292 nm 处和 pH = 11⁶ 处的紫外吸光度并使用 350 M ^-1cm ^-1 的消光系数来量化 HOCl 储备液的浓度。
3. 在第 2 节中描述的极化处理后，从每个孔中吸出细胞培养基，并用 1 mL 等分试样小心洗涤细胞 3 次:无菌 PBS（用于 PMA、TNFα 和 IL-8）或 HBSS（用于 HOCl），它们已预热至 37 °C。
4. 对于 PMA、TNFα 或 IL-8 的实验:在最后的洗涤步骤中去除 PBS 后，加入 1 mL 含有 PMA、TNFα 或 IL-8 的完全培养基。
5. 对于 TNFα 的实验，在细胞培养箱中，在 37 °C 和 5% CO 2 存在下将细胞孵育 6 小时。对于 PMA 和 IL-8 的实验，在细胞培养箱中，在 5% CO₂ 存在下，在 37 °C 下将细胞孵育 24 小时。
6. 对于使用 HOCl 的实验，在最后的洗涤步骤中去除 HBSS 后，在 HBSS 中加入 1 mL 的 HOCl。然后，在细胞培养箱中，在 37 °C 和 5% CO₂ 存在下将细胞孵育 15 分钟。
   1. 小心吸出细胞上清液，并按照步骤 2.3 中的说明用 1 mL 等分试样的 HBSS 洗涤细胞 3 次。
   2. 从最终洗涤步骤中取出 HBSS 后，加入 1 mL 完整的 RPMI-1640 培养基。然后，在细胞培养箱中，在 37 °C 和 5% CO₂ 存在下将细胞孵育 24 小时。

3. 活细胞培养中 MET 的可视化

1. 在 HBSS 中制备浓度为 40 μM 的 SYTOX 绿色染料。
2. 在第 2 节中描述的处理结束时，为了诱导 MET 释放，直接向每个含有 HMDM 的孔中加入 25 μL 的 40 μM 染料。
3. 在室温 （RT） 下避光孵育细胞 5 分钟。
4. 将 HMDM 放在倒置荧光显微镜显微镜载物台上的组织培养孔中进行成像。
5. 显微镜检查程序
   1. 打开广谱荧光光源、明场光源和装有高分辨率彩色数码相机的倒置显微镜（参见材料表）。
   2. 将滤光片转盘旋转到绿色荧光的"数字 2"位置（激发 = 504 nm，发射 = 523 nm），以便对组织培养孔中包含的绿色染色样品进行成像。
   3. 使用 5 倍物镜，用粗焦聚焦图像，然后将微调焦旋钮放在显微镜上，直到通过显微镜目镜观察时图像清晰、清晰和聚焦。
   4. 将显微镜切换到相机模式。
   5. 启动关联的软件。
   6. 选择 捕获 软件上的选项卡。
   7. 单击"播放"按钮预览图像并调整显微镜上的微调旋钮，直到图像在软件预览窗口中清晰、清晰和聚焦。
   8. 单击 Capture 按钮。
      注意: 拍摄的图像将自动显示在随附的软件中。
   9. 在软件中，单击 文件 |另存为所需的图像文件类型。
   10. 在显微镜上，将滤光片轮旋转到"数字 5"位置进行明场成像，然后重复步骤 3.5.2-3.5.9 以获得相应的明场图像。
   11. 根据需要重复步骤 3.5.2–3.5.10 以进行后续图像采集。

材料