体外刺激与巨噬细胞外陷阱的可视化

摘要

来源：Zhang, Y.，等。人单核细胞来源巨噬细胞分化后体外刺激及细胞外诱捕网释放的可视化观察。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示 体外 使用不同炎症刺激物（如TNF-α、PMA和HOCL）诱导人单核细胞来源巨噬细胞产生巨噬细胞胞外诱捕网（METs）。视频还展示了利用SYTOX染料对METs进行染色以实现可视化的方法。

方案

1. HMDM的极化

1. 在无菌条件下，通过向完全RPMI-1640培养基中添加干扰素γ（IFNγ；20 ng/mL）和脂多糖（LPS；1 μg/mL）来制备M1极化培养基。通过向完全RPMI-1640培养基中添加白细胞介素4（IL-4；20 ng/mL）来制备M2极化培养基。
2. 在无菌条件下，吸除已接种并按第1节所述培养的人源单核细胞来源巨噬细胞（HMDM）所在组织培养板孔中的培养基。
3. 使用1 mL无菌PBS（预热至37 °C），小心地对含有细胞的孔进行3次洗涤。
4. 向每孔HMDM中加入1 mL M1或M2极化培养基（根据实验需求选择合适的一种）。
5. 将细胞置于细胞培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育48小时。

2. 刺激HMDM以诱导MET释放

1. 在无菌条件下，向完全RPMI-1640培养基中加入不同巨噬细胞胞外诱捕网（MET）释放刺激物（根据实验需要选择适当刺激物）：PMA（25 nM）、人重组TNFα（25 ng/mL）或人重组IL-8（50 ng/mL）。
2. 对于次氯酸（HOCl）刺激实验，在将 HOCl 加入细胞前，立即用预热至 37 °C 的 HBSS 配制 200 μM 的 HOCl 溶液。确保不要在完全培养基中配制 HOCl。
   注意： 通过测量溶液在292 nm处的紫外吸光度及pH = 11的条件，定量分析次氯酸（HOCl）储备液的浓度⁶ 并使用350 M的消光系数^-1厘米^-1.
3. 在完成第2节所述的极化处理后，吸出每个孔中的细胞培养基，并用1 mL预热至37 °C的无菌PBS（用于PMA、TNFα和IL-8检测）或HBSS（用于HOCl检测）小心洗涤细胞3次。
4. 对于使用PMA、TNFα或IL-8的实验：在最后一次洗涤步骤中移除PBS后，加入含有PMA、TNFα或IL-8的完全培养基1 mL。
5. 对于TNFα实验，在细胞培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下孵育细胞6小时。对于PMA和IL-8实验，在细胞培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下孵育细胞24小时。₂ 在细胞培养箱中。
6. 在使用 HOCl 的实验中，于最后洗涤步骤去除 HBSS 后，加入 1 mL HOCl 的 HBSS 溶液。随后，在 5% CO₂ 条件下于 37 °C 孵育细胞 15 分钟。₂ 在细胞培养箱中。
   1. 小心吸除细胞上清液，并按照步骤2.3所述，用1 mL等分的HBSS洗涤细胞3次。
   2. 在完成最后一次洗涤步骤并移除HBSS后，加入1 mL完全RPMI-1640培养基。随后，在37 °C、5% CO₂条件下将细胞培养24 h。₂ 在细胞培养箱中。

3. 活细胞培养中MET的可视化

1. 将SYTOX Green染料用HBSS配制成40 μM的浓度。
2. 在第2节所述处理结束时，为诱导MET释放，直接向每孔含HMDM的培养孔中加入25 μL的40 μM染料。
3. 将细胞在室温（RT）避光孵育5分钟。
4. 将含HMDM的组织培养板置于倒置荧光显微镜的载物台上，进行成像。
5. 显微镜操作步骤
   1. 打开宽谱荧光光源、明场光源，以及配备高分辨率彩色数码相机的倒置显微镜（参见材料表）。
   2. 将滤光轮旋转至“2号”位置，用于绿色荧光成像（激发波长 = 504 nm，发射波长 = 523 nm），以对组织培养孔中的绿色染色样本进行成像。
   3. 使用5倍物镜，先通过显微镜的粗调焦旋钮，再用细调焦旋钮进行对焦，直至通过显微镜目镜观察时图像清晰、锐利且聚焦准确。
   4. 将显微镜切换至相机模式。
   5. 启动配套软件。
   6. 在软件中选择“捕获”选项卡。
   7. 点击“播放”按钮预览图像，并调节显微镜上的细调焦旋钮，直至软件预览窗口中的图像清晰、锐利且聚焦准确。
   8. 点击“捕获”按钮。
      注意：捕获的图像将自动显示在配套软件中。
   9. 在软件中，点击“文件”|“另存为”，选择所需的图像文件格式进行保存。
   10. 在显微镜上，将滤光轮旋转至“5号”位置，用于明场成像，并重复步骤3.5.2–3.5.9，以获取相应的明场图像。
   11. 根据需要，重复步骤3.5.2–3.5.10，进行后续图像采集。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
120Q 宽谱荧光光源	EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada	x-cite series
Corning CellBIND 多孔培养板（12 孔）	Sigma-Aldrich	CLS3336	用于细胞培养
次氯酸（HOCl）	Sigma-Aldrich	320331	用于 MET 刺激
干扰素 γ	Thermo-Fisher	PMC4031	用于 M1 极化
白细胞介素 4	Integrated Sciences	rhil-4	用于 M2 极化
白细胞介素 8	Miltenyl Biotec	130-093-943	用于 MET 刺激
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	59202C	添加至培养基中
Olympus IX71 倒置显微镜	Olympus, Tokyo, Japan
佛波酯 12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P8139	用于 MET 刺激
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	D5652	用于洗涤步骤
RPMI-1640 培养基	Sigma-Aldrich	R8758	用于细胞培养
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	用于 MET 可视化
TH4-200 明场光源	Olympus, Tokyo, Japan		x-cite series
肿瘤坏死因子 α	Lonza	300-01A-50	用于 MET 刺激