一种检测细菌胞外蛋白介导的中性粒细胞毒性作用的实验方法

摘要

来源：Dankoff, J. G., 等 量化细胞毒性 金黄色葡萄球菌 抗人多形核白细胞 视频实验杂志 (2020).

本视频展示了一种检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）——一种致病性细菌——产生的细胞毒性蛋白对分离的人类多形核白细胞（PMNs）毒性的实验方法。这些分泌的细胞毒性蛋白会在PMN细胞膜上形成孔道，从而引发细胞死亡。通过使用碘化丙啶对死亡细胞进行染色，随后进行流式细胞术，以定量分析死亡细胞数量，评估该细菌的细胞毒性。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 人多形核白细胞的纯化及人血清的分离

注意：所有试剂应使用市售的内毒素检测试剂盒常规检测内毒素的存在，且内毒素含量应<25.0 pg/mL，以防止中性粒细胞发生非预期的激活。

1. 将50 mL的3%葡聚糖-0.9% NaCl（w/v）、35 mL的0.9% NaCl（w/v）、20 mL的1.8% NaCl（w/v）、12 mL的1.077 g/mL密度梯度溶液以及20 mL的注射级或灌注级水置于室温。
2. 为分离人血清，将4 mL新鲜采集的无抗凝剂人血在37 °C下于15 mL玻璃管中孵育30分钟。孵育后，在室温下以2,000–3,000 × g离心10分钟。将上层血清转移至新的15 mL锥形离心管中，并置于冰上。
3. 在两个重复的50 mL锥形离心管中（每管总体积为50 mL），将25 mL新鲜采集的肝素化（1000单位/mL）全人血与25 mL室温下的3%葡聚糖-0.9% NaCl（1:1比例）混合。通过轻轻摇动每个50 mL锥形管进行混匀，然后在室温下静置30分钟。
4. 室温孵育后，将出现两层分离的液体。将每份葡聚糖-血液混合物的上层转移至新的50 mL锥形管中，并在室温下以450 × g离心10分钟，使用低速或无刹车。
5. 小心吸除上清液并弃去，避免扰动细胞沉淀。将每份细胞沉淀轻轻重悬于2 mL室温0.9% NaCl中，合并重悬的细胞沉淀至一个50 mL锥形管中，然后加入剩余的0.9% NaCl（最终体积为35 mL）。
6. 使用手动移液器，将10 mL室温下的1.077 g/mL密度梯度溶液小心地铺在细胞悬液下方。在室温下以450 × g离心30分钟，使用低速或无刹车。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。上清液中含有外周血单个核细胞，可按前述方法收集。
7. 通过将细胞沉淀重悬于20 mL室温水中裂解红细胞。轻轻摇动管子30秒进行混匀。红细胞裂解过程中将伴随明显的浊度下降。
8. 立即加入20 mL室温下的1.8% NaCl（RT），并在室温下以450 × g离心10分钟。
   注意：为最大化中性粒细胞（PMN）得率并防止PMN裂解和/或激活，应尽量缩短PMN在红细胞裂解后单独处于水中的时间。
9. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞沉淀轻轻重悬于2 mL室温RPMI 1640培养基中，并置于冰上。
10. 使用血细胞计数板计数细胞。将纯化的PMN以1 × 10⁷ 个细胞/mL的浓度重悬于冰冻RPMI中，并保持在冰上。
11. 在两个重复的流式细胞术管中，将100 µL纯化的PMN（1 × 10⁶ 个细胞）与300 µL含1 µL碘化丙啶染料的冰冻Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）混合。为设置细胞膜损伤的阳性对照，向其中一个流式细胞术管中加入40 µL 0.5% Triton X-100溶液，并充分混匀。
12. 使用流式细胞术检测纯化细胞的前向散射、侧向散射及碘化丙啶染色情况（激发/发射最大值为535/617 nm）（图1）。
    注意：前向散射和侧向散射分析可识别不需要的淋巴细胞和单核细胞群体。碘化丙啶仅对细胞膜受损的细胞进行染色，若纯化的PMN中碘化丙啶阳性细胞比例显著升高，则不应使用。在本研究中，仅当纯化细胞中PMN占比>98%且碘化丙啶阳性细胞比例<5%时，才使用该批PMN。
13. 为进行PMN细胞毒性检测，准备一块96孔板，将用于该实验的各孔用100 µL以DPBS稀释的20%分离人血清包被。
    注意：将PMN直接接种于塑料或玻璃表面会导致细胞激活。务必至少设置一个仅加入培养基的阴性对照孔，以及一个加入0.05% Triton X-100的阳性对照孔。
14. 将板在37 °C孵育30分钟。孵育后，用冰冻DPBS洗涤包被孔两次，以去除多余血清。轻轻倒置拍打平板以去除残留DPBS，并将板置于冰上。
15. 向每个包被孔中轻轻加入100 µL浓度为1 × 10⁷ 个细胞/mL的纯化人PMN（每孔1 × 10⁶ 个PMN）。将平板置于冰上孵育至少5分钟，使PMN沉降至孔底。保持平板水平，以确保各孔中细胞均匀分布，并始终置于冰上以避免PMN非预期激活。

2. 细胞毒性检测 S. aureus 针对人多形核白细胞的细胞外蛋白

1. 培养 S. aureus 在37 °C摇床培养箱中，于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中过夜培养。在这些研究中，分别在150 mL锥形瓶中加入20 mL TSB，并接种冻存的菌种培养物 S. aureus 菌株 USA300 或 USA300ΔsaeR/S 并在250 rpm振荡条件下培养约14小时。
2. 传代培养 S. aureus 通过将过夜培养的细菌培养物用新鲜培养基进行1:100稀释。在37 °C条件下振荡培养，直至细菌达到早期稳定生长期。
   注意： 在这些实验中，向含有20 mL胰蛋白胨大豆肉汤的150 mL锥形瓶中接种200 µL过夜培养的USA300或USA300ΔsaeR/S 37 °C、250 rpm 摇床培养 5 小时。
3. 当细菌达到早期稳定生长期时，转移1 mL的传代培养物 S. aureus 加入1.5 mL离心管中，于5,000 × g 室温下孵育5分钟。
4. 离心后，将上清液转移至一支3 mL注射器中。将上清液经0.22 µm滤膜过滤，收集至预置冰上的新的1.5 mL微量离心管中。
5. 用预冷的培养基对上清液进行系列稀释 S. aureus.
   注意： 对于所示实验，使用了来自 USA300 和 USA300Δ 的上清液saeR/S 用预冷的TSB进行连续四次1/2 log稀释。
6. 轻轻将上清液样本或单独的培养基（用于阴性与阳性对照）加入含有来自步骤1.15冰上中性粒细胞（PMNs）的96孔板的各个孔中。在这些实验中，加入10 µL的USA300或USA300ΔsaeR/S 将上清液样品加入各孔中。轻轻摇动酶标板，使上清液在孔中均匀分布，于37 °C孵育。
7. 在预定时间将培养板从培养箱中取出，置于冰上。向阳性对照孔中加入 40 µL 的 0.5% Triton X-100。
8. 轻轻吹打每个孔中的样品，使粘附在板上的所有中性粒细胞完全脱落，然后将样品转移至预置冰上的流式管中，管中已含有300 µL冰浴DPBS和1 µL碘化丙啶。
9. 使用流式细胞术测定碘化丙啶阳性中性粒细胞的比例 （图2A）当与DNA结合时，碘化丙啶的激发/发射波长为535/617 nm。

结果

图1：纯化中性粒细胞的流式细胞术分析。 （A）纯化的人中性粒细胞和（B）人为污染了外周血单个核细胞的中性粒细胞的代表性流式细胞术散点图。（C）代表性流式细胞术直方图显示，与经0.05% Triton X-100处理的中性粒细胞（灰色阴影）相比，纯化中性粒细胞的碘化丙啶染色率极低（<1%）（灰色阴影）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠注射液，USP，500 mL VIAFLEX 塑料容器	Baxter	2B1323Q	PMN 纯化
1.5 mL 带 snap cap 的微量离心管	VWR	89000-044	用于洗涤细胞
1.8% 氯化钠溶液	Sigma-Aldrich	S5150	PMN 纯化
12x75 mm 培养管	VWR	60818-430	用作流式细胞术检测管
20% (w/w) 葡聚糖	Sigma-Aldrich	D8802	PMN 纯化
3125 手持计数器	Traceable Products	3125CC	用于细胞计数
50 mL 锥形离心管	VWR	89039-656	用于分装培养基
Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤，大豆-酪蛋白消化物培养基	FischerScientific	211823	用于细胞培养增殖
BD 带鲁尔锁头的一次性注射器，3 mL	FischerScientific	BD 309657	用于过滤上清液
Bright-Line 血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629	细胞计数装置
DPBS, 1x (Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水)，含钙和镁	Corning	21-030-CV	用于洗涤细胞
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	PMN 纯化
Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性移液管	FischerScientific	13-678-11E	用于吸取液体
Greiner CELLSTAR 96 孔板	Millipore Sigma	M0687	用于盛放实验样品的微孔板
OMICRON 注射器滤器	Omicron Scientific	SFPV13R	用于过滤上清液
碘化丙啶	ThermoFisher Scientific	P3566	细胞膜非通透性 DNA 染料
PYREX 品牌 4980 锥形瓶	Cole-Parmer	EW-34503-24	用于细胞培养增殖
RPMI 1640, 1X，不含 L-谷氨酰胺和酚红	Corning	17-105-CV	用于重悬细胞
无菌冲洗用水，USP	Baxter	2F7113	PMN 纯化
The Pipette Pump	Bel-Art Products	F37898	用于吸取液体
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	细胞膜完整性阳性对照