一种检测细菌胞外蛋白介导的中性粒细胞毒性作用的实验方法

摘要

来源：Dankoff, J. G., 等 量化细胞毒性 金黄色葡萄球菌 抗人多形核白细胞 视频实验杂志 (2020).

本视频展示了一种检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）——一种致病性细菌——产生的细胞毒性蛋白对分离的人类多形核白细胞（PMNs）毒性的实验方法。这些分泌的细胞毒性蛋白会在PMN细胞膜上形成孔道，从而引发细胞死亡。通过使用碘化丙啶对死亡细胞进行染色，随后进行流式细胞术，以定量分析死亡细胞数量，评估该细菌的细胞毒性。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 人多形核白细胞的纯化及人血清的分离

注意：所有试剂应使用市售的内毒素检测试剂盒常规检测内毒素的存在，且内毒素含量应<25.0 pg/mL，以防止中性粒细胞发生非预期的激活。

1. 将50 mL的3%葡聚糖-0.9% NaCl（w/v）、35 mL的0.9% NaCl（w/v）、20 mL的1.8% NaCl（w/v）、12 mL的1.077 g/mL密度梯度溶液以及20 mL的注射级或灌注级水置于室温。
2. 为分离人血清，将4 mL新鲜采集的无抗凝剂人血在37 °C下于15 mL玻璃管中孵育30分钟。孵育后，在室温下以2,000–3,000 × g离心10分钟。将上层血清转移至新的15 mL锥形离心管中，并置于冰上。
3. 在两个重复的50 mL锥形离心管中（每管总体积为50 mL），将25 mL新鲜采集的肝素化（1000单位/mL）全人血与25 mL室温下的3%葡聚糖-0.9% NaCl（1:1比例）混合。通过轻轻摇动每个50 mL锥形管进行混匀，然后在室温下静置30分钟。
4. 室温孵育后，将出现两层分离的液体。将每份葡聚糖-血液混合物的上层转移至新的5....

结果

图1：纯化中性粒细胞的流式细胞术分析。 （A）纯化的人中性粒细胞和（B）人为污染了外周血单个核细胞的中性粒细胞的代表性流式细胞术散点图。（C）代表性流式细胞术直方图显示，与经0.05% Triton X-100处理的中性粒细胞（灰色阴影）相比，纯化中性粒细胞的碘化丙啶染色率极低（<1%）（灰色阴影）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠注射液，USP，500 mL VIAFLEX 塑料容器	Baxter	2B1323Q	PMN 纯化
1.5 mL 带 snap cap 的微量离心管	VWR	89000-044	用于洗涤细胞
1.8% 氯化钠溶液	Sigma-Aldrich	S5150	PMN 纯化
12x75 mm 培养管	VWR	60818-430	用作流式细胞术检测管
20% (w/w) 葡聚糖	Sigma-Aldrich	D8802	PMN 纯化
3125 手持计数器	Traceable Products	3125CC	用于细胞计数
50 mL 锥形离心管	VWR	89039-656	用于分装培养基
Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤，大豆-酪蛋白消化物培养基	FischerScientific	211823	用于细胞培养增殖
BD 带鲁尔锁头的一次性注射器，3 mL	FischerScientific	BD 309657	用于过滤上清液
Bright-Line 血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629	细胞计数装置
DPBS, 1x (Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水)，含钙和镁	Corning	21-030-CV	用于洗涤细胞
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	PMN 纯化
Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性移液管	FischerScientific	13-678-11E	用于吸取液体
Greiner CELLSTAR 96 孔板	Millipore Sigma	M0687	用于盛放实验样品的微孔板
OMICRON 注射器滤器	Omicron Scientific	SFPV13R	用于过滤上清液
碘化丙啶	ThermoFisher Scientific	P3566	细胞膜非通透性 DNA 染料
PYREX 品牌 4980 锥形瓶	Cole-Parmer	EW-34503-24	用于细胞培养增殖
RPMI 1640, 1X，不含 L-谷氨酰胺和酚红	Corning	17-105-CV	用于重悬细胞
无菌冲洗用水，USP	Baxter	2F7113	PMN 纯化
The Pipette Pump	Bel-Art Products	F37898	用于吸取液体
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	细胞膜完整性阳性对照