细胞毒性检测 金黄色葡萄球菌 吞噬作用后中性粒细胞所受应变

摘要

来源：Dankoff, J. G. 等., 量化细胞毒性 金黄色葡萄球菌 抗人多形核白细胞 视觉实验杂志. (2020)

在本视频中，我们演示了一种检测毒力较强和较弱的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株在被吞噬后对人中性粒细胞产生细胞毒性的实验方法，该方法采用流式细胞术进行分析。

方案

1. S. aureus吞噬后对人多形核白细胞的细胞毒性检测

注意：在开始本实验之前，必须针对待测的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株，通过实验经验确定其在600 nm处的光密度（OD600）与细菌浓度所定义的生长曲线。这些实验的成功依赖于在次级培养细菌的对数生长中期，以OD600为依据，始终如一地收获每种待测S. aureus菌株的相同浓度菌液。

1. 接种 S. aureus 菌株的过夜培养物，并按以下方法进行传代培养。
   1. 在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，使用设定为 37 °C 的摇床培养箱对 S. aureus 进行过夜培养。在本研究中，将冻存的 S. aureus 菌株 USA300 或 USA300ΔsaeR/S 接种至含有 20 mL TSB 的 150 mL 三角烧瓶中，于 250 rpm 振荡条件下培养约 14 小时。
   2. 将过夜培养的细菌以 1:100 的比例稀释至新鲜培养基中，对 S. aureus 进行传代培养。在 37 °C 条件下振荡孵育。
2. 当传代培养的 S. aureus 达到对数中期生长阶段时，取 1 mL 培养菌液转移至 1.5 mL 微量离心管中，在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟，收集菌体。
   注意：在本实验的培养条件下，USA300 和 USA300ΔsaeR/S 菌株在孵育约 135 分钟后进入对数中期。
3. 离心后，吸除上清液，将菌体沉淀重悬于 1 mL DPBS 中，涡旋振荡 30 秒，然后在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟，洗涤 S. aureus。
4. 将菌体沉淀重悬于 1 mL 用 DPBS 稀释的 20% 人血清中，在 37 °C 条件下振荡孵育 15 分钟，对 S. aureus 进行调理。
5. 将调理后的细菌在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟。离心后，吸除上清液，将菌体沉淀重悬于 1 mL DPBS 中，涡旋振荡至菌体沉淀完全分散，再额外涡旋 30 秒。随后在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟。
6. 将调理后的 S. aureus 菌株重悬于 1 mL RPMI 培养基中，涡旋振荡至菌体沉淀完全分散，再继续涡旋 30 秒。将菌液置于冰上。
7. 用预冷的 RPMI 将调理后的 S. aureus 菌株稀释至所需浓度。涡旋振荡 30 秒后置于冰上。
8. 通过将细菌进行 1:10 系列稀释后涂布于胰蛋白胨大豆琼脂平板，确认调理后 S. aureus 的浓度。
   注意：由于本实验中使用的细菌浓度差异会显著影响后续中性粒细胞（PMN）质膜通透性（图 1A），因此每次实验均需测定各菌株的实际浓度，并确保各菌株间浓度一致。
9. 在冰上，向 96 孔板中的 PMN 每孔轻柔加入 100 µL 各 S. aureus 菌株或 RPMI（分别作为阳性和阴性对照）。轻柔摇动培养板，使 S. aureus 在各孔中均匀分布。
10. 将培养板在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 8 分钟，同步启动吞噬作用。离心后立即转移至 37 °C 培养箱中孵育（T = 0）。
11. 在设定的时间点，将培养板从孵育箱中取出并置于冰上。向阳性对照孔中加入 40 µL 0.5% Triton X-100。
12. 用移液器轻柔吹打各孔样品，彻底脱离所有贴壁的 PMN，然后将样品转移至含有 200 µL 预冷 DPBS 和 1 µL 碘化丙啶的流式细胞术管中，置于冰上。
13. 使用流式细胞术检测样品的碘化丙啶染色情况。
14. 使用流式细胞术测定碘化丙啶阳性 PMN 的比例。碘化丙啶与 DNA 结合后，其激发/发射波长为 535/617 nm。

结果

图1：中性粒细胞吞噬后的流式细胞术分析 S. aureus. (A) 吞噬不同浓度的 USA300 或 USA300∆saeR/S 后 90 分钟，碘化丙啶阳性中性粒细胞（PMNs）的比例。B用于实验的调理化金黄色葡萄球菌菌株浓度见图A。数据为4次独立实验的均值±标准误，*p ≤ 0.01，由双尾t检验确定。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带旋盖的1.5 mL 微型离心管	VWR	89000-044	用于洗涤细胞
12×75 mm 培养管	VWR	60818-430	用作流式细胞术管
50 mL 锥形离心管	VWR	89039-656	用于分装培养基
Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤，大豆-酪蛋白消化物培养基	FischerScientific	211823	用于细胞培养的生长
Bright-Line 血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629	细胞计数装置
含钙和镁的1× DPBS（杜氏磷酸盐缓冲液）	Corning	21-030-CV	用于洗涤细胞
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	中性粒细胞（PMN）纯化
Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性移液管	FischerScientific	13-678-11E	用于吸取液体
Greiner CELLSTAR 96 孔板	Millipore Sigma	M0687	用于盛放实验样品的板
OMICRON 注射器滤器	Omicron Scientific	SFPV13R	用于过滤上清液
碘化丙啶	ThermoFisher Scientific	P3566	细胞膜非通透性DNA染料
PYREX 品牌 4980 锥形瓶	Cole-Parmer	EW-34503-24	用于细胞培养的生长
不含L-谷氨酰胺和酚红的RPMI 1640 1× 溶液	Corning	17-105-CV	用于重悬细胞
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	细胞膜完整性阳性对照