用于活体追踪细菌感染的报告酶荧光成像

摘要

来源：Sharan, R.，等。利用报告酶荧光成像小鼠体内的Mycobacterium tuberculosis。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了报告酶荧光（REF）成像技术 体内 检测 结核分枝杆菌 感染后，通过腹腔注射给予小鼠用于REF成像的底物。该底物被细菌β-内酰胺酶水解后会发出荧光，检测该荧光有助于评估感染情况。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 菌株与培养条件

注意：本研究使用结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌株CDC1551，但任何结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌株均可采用相同方法使用。

1. 在M-OADC-TW（含0.5%甘油、10%不含过氧化氢酶的油酸-葡萄糖复合物及0.05%Tween-80的7H9肉汤）培养基中，于37 °C静置培养细菌至OD₆₀₀为0.5（约0.2 × 10⁷菌落形成单位，即CFU）。
2. 将菌液用M-OADC-TW培养基进行系列10倍稀释（1:10梯度稀释）。取稀释后的菌液（10⁵、10⁶、10⁷、10⁸）各三份，接种于选择性7H11平板，用于测定CFU。
3. 将平板在37 °C培养四周，或直至菌落可被准确计数。
4. 将细菌接种物在8,534 × g离心5分钟，收集菌体沉淀。用10 mL生理盐水（0.9% NaCl）洗涤沉淀一次，并将沉淀重悬于15 mL生理盐水（0.9% NaCl）中。

2. 使用 Madison 气雾感染装置对小鼠进行气溶胶感染

1. 让小鼠在新环境中适应一周。
2. 将小鼠放入腔室前称重。
3. 将三根电源线依次插入电源插座：主腔室电源、真空泵和空气压缩机。
4. 小心拧开玻璃罐，将玻璃罐移至生物安全柜中，加入悬浮于15 mL生理盐水（0.9% NaCl）中的攻击接种物，使终浓度约为10⁴ - 10⁶ 肺组织中细菌的菌落形成单位（CFU）
5. 在生物安全柜中盖上玻璃罐的盖子。将罐体连接至雾化器装置，并调节垂直的不锈钢管，使下端（进气端）位于罐内液面下方约四分之一英寸处。
6. 将实验所需的所有动物（腔室最多可容纳90只小鼠）放入腔室，并关闭门上的所有锁扣。
7. 检查主（房间）空气流量计。确保浮子（小球）中心位于左侧刻度所示的约50 L/min处。
8. 按下舱室控制面板上的启动按钮。将压缩机空气流量计（左侧较小的流量计）的气流速率调节至刻度显示4 L/min。通过目视检查，确保攻毒接种物正在被雾化。
9. 15分钟后，当控制面板前方的红灯亮起且发出声音信号提示运行结束时，按下控制面板右下角的复位按钮以重置计时器。
10. 按住腔室门上的小型红色按钮以释放真空。
11. 打开舱门并取出动物，将小鼠放回各自的笼具中。
12. 取下玻璃雾化器罐，放入密封且防漏的转运容器中。将该容器置于生物安全柜内，并将挑战悬浮液弃置到指定的废物容器中。
13. 将使用过的雾化器罐放入生物危害袋中，并密封袋子以便转运至高压灭菌器。
14. 感染程序结束后，用缓冲酚和70%乙醇喷洒培养 chamber 内部，静置10分钟。
15. 然后，彻底擦拭所有可触及的内部表面。丢弃所有被污染的纸巾。 等等丢弃至生物危害垃圾桶中。对垃圾、废液容器和使用过的雾化瓶进行高压灭菌处理。
16. 将动物放回饲养室，直至成像时间点。
17. 成像当天，将动物转移至次级容器中，并送至成像室。

3. 动物麻醉

1. 使用定制的气体麻醉系统，以异氟烷对小鼠进行麻醉。
2. 称量位于麻醉机顶部的两个活性炭过滤罐各自的重量。
3. 如果过滤罐重量比初始重量增加50 g，则更换为新的过滤罐。
4. 检查蒸发器单元，确保异氟烷的存量足以完成实验操作。
5. 将鼻罩支架放入成像室中。根据实验所需放置相应数量的鼻罩，并使用鼻罩堵头将剩余开口密封。
6. 打开高压氧气瓶的氧气供应，并将压力调节至55 psi。
7. 打开位于麻醉机前方的废气抽吸泵，并将流速设置为8 L/min。
8. 打开位于麻醉机前方的氧气开关。
9. 打开至麻醉诱导室的气体流量，将气体流速设定为1.5 L/min，随后关闭气体流量。
10. 打开至成像室的气体流量，将气体流速设定为0.25 L/min，随后关闭气体流量。
11. 打开异氟烷蒸发器，并将浓度设定为2–2.5%。根据实验所用动物的数量和体重，通过旋转蒸发器上的旋钮调节异氟烷浓度（对于体重约20 g的小鼠，使用2–2.5%；对于体重300 g的豚鼠，使用4%）。
12. 将小鼠放入麻醉诱导室中并盖上盖子，然后打开至麻醉诱导室的气体流量。
13. 让小鼠在麻醉诱导室内停留5–10分钟，直至完全麻醉。
14. 小鼠麻醉后，在其眼睛上涂抹眼用油膏，以在成像过程中保护角膜。
15. 将小鼠置于腹卧位或胸骨卧位，使其鼻部置于鼻罩中，以便在成像过程中持续维持麻醉状态。

4. 报告酶荧光（REF）成像

1. 通过腹腔注射将底物（20 µM，2.5 µL/g 体重）注入感染小鼠及对照小鼠体内。小鼠在成像舱内处于麻醉状态，时间少于1分钟。
2. 启动成像系统。
3. 点击“Initialize”初始化系统，等待温度指示条变为绿色。
   注意：成像舱内含加热平台，用于在成像过程中维持动物体温。
4. 在成像采集设置中，选择荧光 | 全身成像选用透射照明，肺组织成像则选用落射照明，并在采集控制面板中选择“Structure and Overlay”模式。
5. 视野选择B档用于单只小鼠，光源强度设为高。
6. 曝光时间设为自动，中等 binning，f/stop 设为2–3，激发滤光片设为745 nm，发射滤光片范围设为780 nm 至 840 nm。
7. 在序列设置中，点击“Sequence Setup”，并在肺部区域选择9–12个透射照明采集点。
8. 点击“Acquire”开始图像采集。
9. 成像完成后将小鼠放回笼中。
10. 监测小鼠直至其完全恢复；若在实验特定时间点进行成像，可选择处死小鼠以定量CFU。成像后采用改良Karnofsky评分评估小鼠健康状况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	VETONE	501027
CNIR800	定制合成
致命性安乐死溶液（Fatal Plus solution）	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook 肉汤	BD	271310
OADC Middlebrook 增菌液	BD	212351
孢子杀灭剂（Sporcidin）		RE-1284F
7H11 Middlebrook 琼脂	BD	212203
麦迪逊腔室（Madison Chamber）
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262
XGI-8 气体麻醉系统	Perkin Elmer
Living Imaging 软件	Perkin Elmer
透明鼻罩	Perkin Elmer
结核分枝杆菌菌株 CDC1551	ATCC
雌性 BALB/C 小鼠，5–7 周龄	Jackson Laboratory