在培养的巨噬细胞中评估Leishmania Virulence

摘要

来源：Sarkar, A. 等，巨噬细胞内寄生虫生长量的定量是一种快速且可靠的评估利什曼原虫毒力的方法。视频实验杂志（2018）

本视频通过用前鞭毛体处理巨噬细胞，研究Leishmania的毒力，从而形成细胞内无鞭毛体。通过核酸荧光染料染色确认Leishmania的毒力。该研究有助于利什曼病新疗法的开发。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 骨髓来源巨噬细胞（BMMs）的分离与分化

1. 第0天： 在CO₂麻醉舱中处死4至6周龄的雌性C57BL/6或BALB/c小鼠，并通过颈椎脱位确认死亡。将剪刀和镊子浸泡于70%乙醇中以确保其无菌。在整个骨髓细胞分离过程中，用70%乙醇喷洒手套，以实现无菌操作。
2. 将已处死的小鼠四肢朝下固定于解剖板上，并大量喷洒70%乙醇进行消毒。
3. 用剪刀在髋关节附近做一个小切口（约1 cm）。小心地将剪刀插入皮肤下方，分离下方肌肉组织，并围绕髋关节剪开皮肤。
   注意： 可旋转解剖板以更方便地接近髋关节。
4. 小心地将腿部皮肤向脚踝方向剥离并去除。在踝关节处剪除足部，注意切割位置应在踝关节处或以下，以确保胫骨完整保留。
   注意： 此时腓骨连接较松，可用镊子轻松分离。
5. 手动活动股骨以定位髋关节，确定其旋转点。小心使用剪刀在髋关节上方切断腿部，保留股骨近端头部完整。
6. 用剪刀尽可能去除腿部的肌肉和结缔组织。清除脚踝处残留的皮肤以及髋关节上方多余的骨组织。
7. 将清理干净的腿骨放入含青霉素/链霉素（终浓度1%）的无菌RPMI培养基中，置于冰上的培养皿内。
8. 重复步骤1.4至1.6，分离另一后肢的胫骨和股骨。
9. 使用无菌镊子和无菌#10刀片，去除浸泡在RPMI中的骨骼上残留的肌肉和结缔组织。
10. 将骨骼放置在培养皿盖上。用刀片在踝关节正上方小心切割胫骨，以暴露骨髓。在膝关节正下方切割，将胫骨从其余腿部组织中分离。
11. 用10 mL注射器吸取10 mL含青霉素/链霉素（终浓度1%）的无菌RPMI培养基，并安装25G针头。
12. 用镊子牢固夹住胫骨，垂直置于冰上放置的50 mL锥形管上方。用注射器将约5 mL RPMI培养基缓慢注入骨端，将骨髓从另一端冲出至锥形管中。共使用10 mL RPMI冲洗骨髓，直至骨骼变白。
    注意： 充分冲洗后，骨骼应呈现白色；若未达到，需继续冲洗以彻底清除骨髓。若胫骨远端过于狭窄无法插入针头，可用刀片适当修剪。
13. 在膝关节正上方和髋关节正下方切割股骨，暴露骨两端以获取骨髓。以与胫骨相同的方式，共使用10 mL RPMI冲洗股骨骨髓。
14. 对剩余骨骼重复步骤1.6至1.13的清洗和冲洗操作，并将所有冲洗所得骨髓细胞收集至同一个50 mL锥形管中。
    注意： 若在冲洗前解剖过程中骨骼发生断裂，则不得使用该骨骼的骨髓。
15. 将用于收集四根骨骼骨髓的锥形管在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。
16. 向带有滤盖的175 cm²细胞培养瓶中加入60 mL无菌BMM培养基（含20%胎牛血清FBS、1%青霉素/链霉素、1.2 mM Na-丙酮酸钠、25 µg/mL人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的RPMI培养基）。
17. 离心后弃去上清液，用培养瓶中的5 mL BMM培养基轻轻吹打重悬细胞沉淀。
18. 将细胞悬液转移至培养瓶中，并用培养瓶中的BMM培养基冲洗锥形管两次，以确保最大程度回收细胞。充分混匀细胞悬液后，将初始175 cm²培养瓶中的30 mL细胞悬液分装至另一个带滤盖的175 cm²培养瓶中。
19. 将两个各含30 mL细胞悬液的培养瓶置于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下过夜培养，以使可能存在的成纤维细胞、定居巨噬细胞及其他贴壁细胞充分分离。
20. 第1天： 将含有未分化骨髓细胞的上清液从培养瓶转移至非组织培养处理的聚苯乙烯培养皿（100 mm × 15 mm）中，每皿约10 mL，在37 °C、5% CO₂条件下继续培养。弃去原培养瓶。
21. 第3或第4天： 向每块培养皿中额外加入5 mL预热至37 °C的BMM培养基，并继续在37 °C、5% CO₂条件下培养。

2. 在盖玻片上接种BMM用于感染（第7或第8天）

1. 在每个空孔底部放置四个（4）个无菌的12 mm玻璃盖玻片（经高压灭菌并储存在密闭玻璃容器中），以准备6孔组织培养板。
   注意： 使用连接真空泵的吸头夹取每个无菌12 mm盖玻片。将盖玻片放入孔中时避免重叠，并通过捏紧管子中断真空，使盖玻片在目标位置释放。
2. 吸除已接种附着性骨髓来源巨噬细胞（BMM）的培养皿中的培养基（及任何非贴壁细胞），并用预热至37 °C的无钙镁氯化物的无菌Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS -/-）轻轻冲洗贴壁细胞2次。
3. 向每个培养皿中逐滴加入5 mL含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的无菌1×PBS -/-，于37 °C孵育5分钟以解离贴壁的BMM。使用显微镜确认细胞是否已解离。
4. 将所有悬浮于含1 mM EDTA的1×PBS -/-中的解离细胞收集至50 mL锥形管中。用5 mL PBS -/-冲洗每个培养皿2次，并将冲洗液加入细胞悬液中。
   注意： 在收集过程中，可用额外的PBS -/-稀释细胞悬液，以保护巨噬细胞免受EDTA毒性影响。
5. 在4 °C下以300 × g离心10分钟。弃去上清液，用移液器将巨噬细胞重悬于5–10 mL BMM培养基中。将重悬的细胞置于冰上，以防止其附着于管壁或发生聚集。
6. 使用台盼蓝染色排除法在血细胞计数板中计数活细胞。
   注意： 对重悬于5 mL培养基中的BMM细胞进行计数时，通常可将25 µL细胞悬液与445 µL PBS -/-及30 µL 0.4%台盼蓝溶液混合稀释，以便于在血细胞计数板中进行准确计数（最终计算时需考虑20倍的稀释因子）。仅计数未被台盼蓝染色的细胞（活细胞）。若该混合液浓度过高或过低，可调整细胞悬液体积。通常，每只小鼠单次制备的BMM产量在2 × 10⁷至5 × 10⁷个细胞之间。
7. 将细胞悬液用BMM培养基调整至所需接种浓度（5 × 10⁵/mL），并将2 mL细胞悬液分配至6孔板的每个孔中，使每孔含有1 × 10⁶个巨噬细胞。
   注意： 此为关键步骤，可确保每孔获得足够数量的巨噬细胞，从而均匀覆盖盖玻片。检查各孔中的盖玻片是否重叠或漂浮于培养基中，如有，可用无菌移液器吸头轻轻调整。
8. 于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。

3. Leishmania amazonensis 感染性虫体的纯化

注意： 为感染实验准备Leishmania——从静止期前鞭毛体培养物中纯化出环形前鞭毛体，或使用标准的L. amazonensis无寄生宿主分化方案将培养中的前鞭毛体分化为无鞭毛体形态。

1. 使用密度梯度介质纯化Leishmania前循环型前鞭毛体（材料）
   1. 在无菌、无内毒素的水中配制40%的密度梯度介质储备液。
   2. 将密度梯度溶液用10倍浓缩的M199培养基（不含血清）稀释，制备成在M199培养基中浓度为10%的溶液。
   3. 所有溶液均通过0.22 µm滤膜过滤。
      注意： 储备液可在避光条件下于4 ^oC保存，但不得超过1个月。
   4. 在15 mL锥形离心管底部加入2 mL 40%密度梯度介质溶液。
   5. 使用巴斯德移液管，小心地将2 mL M199中的10%密度梯度介质溶液叠加在40%密度梯度层上方，避免两层之间发生混合。
   6. 通过在1,900 × g条件下离心10分钟，从静止期培养物中收集1 × 10⁹个寄生虫。
   7. 将细胞重悬于6 mL杜尔贝科改良必需培养基（DMEM）中。
   8. 使用巴斯德移液管，轻轻地将2 mL细胞悬液直接叠加在10%密度梯度介质层上方，避免各层之间混合。
   9. 在室温下以1,300 × g离心10分钟，进行梯度分离。
      注意： 由于不同Leishmania物种的物理特性存在差异，可能需要对每种物种的离心条件进行轻微调整，以确保获得最大产量。
   10. 从上层10%密度梯度介质边界处形成的条带（0%与10%密度梯度介质层之间的界面）收集寄生虫（富含前循环型前鞭毛体）。
   11. 用等体积的DMEM稀释寄生虫，并在室温下以1,900 × g离心10分钟收集。
   12. 重悬于500 µL DMEM培养基中，使用血细胞计数板计数以确定产量。
2. 在无菌培养条件下（低pH/高温）生成L. amazonensis无鞭毛体
   1. 取5 mL对数生长期的前鞭毛体培养物（pH 7.4，26 ^oC），与等体积的无鞭毛体培养基（pH 4.5）混合，使用25 cm²培养瓶（总体积10 mL培养基），并在26 °C下过夜培养。
   2. 将培养瓶从26 °C转移至32 °C。
   3. 3或4天后，在32 °C条件下用无鞭毛体培养基按1:5比例传代培养。
   4. 在接下来的3至4天内（最长不超过7天）检查寄生虫，判断其是否可用于感染实验。
      注意： 健康的无菌培养无鞭毛体应呈椭圆形，无可见鞭毛。部分分化的无鞭毛体呈较大椭圆形并带有短鞭毛。培养物中不应出现大量聚集体——大量聚集体表明寄生虫停止生长并正在死亡。无鞭毛体培养物可按1:5比例传代，最多维持3周。

4. 利什曼原虫亚马逊种（L. amazonensis）感染

1. 根据所需的感染复数（MOI）稀释寄生虫悬液（通常每巨噬细胞感染3-5个前鞭毛体无鞭毛体，即MOI为1:3或1:5；每巨噬细胞感染1个无鞭毛体，即MOI为1:1）。在已含有2 mL培养基的每个孔中加入50–100 µL PBS -/-中的Leishmania。
2. 将BMMs在34 ^oC条件下与无鞭毛体共孵育1小时，或与前鞭毛体共孵育3小时以完成感染。
   注意：最佳感染温度可能因物种而异。
3. 孵育结束后，用预热至37 °C的2 mL PBS -/-彻底清洗每个孔，共洗3次，以去除未结合的寄生虫。
   注意：轻柔地分散PBS，确保盖玻片不会相互重叠。轻轻摇晃培养板后吸出液体。若使用多种寄生虫株，应使用不同的吸头以避免交叉污染。
4. 对1小时或3小时时间点的样本进行固定：每孔加入1.5–2 mL含2% PFA的PBS -/-，孵育10分钟。随后用PBS -/-洗涤3次。最后一次洗涤后不要吸干，将含有盖玻片的培养板置于PBS中并冷藏，直至进行染色。
5. 对于需要继续培养的后续时间点，在每孔中加入2 mL新鲜BMM培养基，并在34 °C下继续孵育。
6. 根据需要，按照步骤4.3所述方法固定其余时间点的样本，并将培养板冷藏至染色前。

5. 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色与盖玻片封片

1. 从含有盖玻片的孔中吸除 PBS，并加入 1.5 mL 含 0.1% 非离子型去污剂的 PBS -/-。室温孵育 10 分钟，随后用 2 mL PBS -/- 洗涤 3 次。
2. 向含有盖玻片的孔中加入 1 mL 含 2 µg/mL DAPI（以水稀释自 5 mg/mL 储存液）的 PBS -/-，室温再孵育 1 小时。
   注意：DAPI 孵育时间对于正确观察胞内 Leishmania 寄生虫至关重要。由于巨噬细胞核体积较大且含有较多脱氧核糖核酸（DNA），其染色较快；而胞内寄生虫的细胞核染色较慢。因此，必须延长孵育时间，超过仅用于观察 BMM 细胞核所需的时间，以使 DAPI 能够穿透寄生虫的质膜和核膜。适当染色后，除细胞核 DNA 外，还可观察到位于寄生虫鞭毛窝附近的线粒体动基体 DNA。
3. 用 2 mL PBS -/- 对每孔中的盖玻片洗涤 3 次，然后用镊子小心提起并翻转盖玻片，使细胞面朝下，置于载玻片上，并使用市售的抗荧光淬灭封片剂进行封片。
   注意：盖玻片极为脆弱，操作需谨慎。避免对其施加压力，尤其是在用镊子提起时勿接触孔壁。加入数滴 PBS -/- 可降低盖玻片与孔板之间的表面张力，有助于顺利取出。可使用细针辅助将盖玻片从孔底撬起。将盖玻片放置于载玻片上后，用镊子轻轻按压，以排出封片剂中的气泡。若盖玻片在操作过程中破裂或可能已翻转，请勿重新封片，直接使用备用的第四张盖玻片即可。
4. 将载玻片冷藏保存，直至进行定量分析。

6. 感染定量

1. 使用100倍油镜（激发波长358 nm，最佳发射波长461 nm）在荧光显微镜下观察经DAPI染色的载玻片，聚焦于巨噬细胞。
   确保聚焦于玻璃载玻片与盖玻片之间的巨噬细胞层。
2. 定量分析巨噬细胞数量（DAPI染色的大细胞核）以及围绕每个巨噬细胞核聚集的较小无鞭毛体细胞核数量（参见 图1A，DAPI）的视野数，使用手动计数器进行计数。
   注意： 由于无鞭毛体的细胞核体积较小，可能无法在同一焦平面上全部观察到。先在聚焦于巨噬细胞细胞核时计数可见的细胞核，然后使用微调焦旋钮检查巨噬细胞细胞核上下焦平面内是否存在寄生虫细胞核。
3. 移动到另一个视野以重复定量分析。使用独立的计数键记录已计数的视野数量。在每个盖玻片上以平行排布的方式移动视野，避免重复计数。
4. 每盖玻片至少定量200个巨噬细胞。每个感染时间点需设置三份重复（3个盖玻片）。若先前的盖玻片因重叠、封片质量差或玻片破裂等原因不适合计数，则计数第四个盖玻片。 等等。
   注意： 如果在任意一个盖玻片上无法计数到200个巨噬细胞，则计数备用的第四个盖玻片。
5. 根据原始定量数据，计算感染率，以每巨噬细胞无鞭毛体数或每100个巨噬细胞中的无鞭毛体数表示，并确定被感染巨噬细胞的百分比。

结果

图1：L. amazonensis 致病性无鞭毛体（A）和非致病性对数生长期前鞭毛体（B）感染骨髓来源巨噬细胞（BMM）的代表性图示。 感染后1小时和48小时从BALB/c小鼠分离的巨噬细胞的免疫荧光图像。感染后的巨噬细胞按本方案所述进行免疫荧光处理。用大鼠抗小鼠Lamp1单克隆抗体（1:1,000稀释）孵育1小时标记寄生泡（PV）膜，随后加入荧光标记的抗大鼠IgG抗体（1:500稀释）孵育1小时。寄生虫染色通过将盖玻片与针对无鞭毛体状态L. amazonensis制备的小鼠多克隆抗体孵育，再加入红色荧光抗小鼠IgG抗体（1:500稀释）完成⁶。所有盖玻片均进一步用DAPI染色细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔细胞培养板	Cellstar	657160
腺嘌呤	Acros Organics	AC147440250
气溶胶阻隔移液器吸头（100–1000 μL）	Fisherbrand	02-707-404
气溶胶阻隔移液器吸头（20–200 μL）	Fisherbrand	02-707-430
气溶胶阻隔移液器吸头（2–20 μL）	Fisherbrand	02-707-432
Bard-Parker 肋背碳钢外科刀片 #10	Aspen Surgical	371110
BD Luer-Lok 尖端 10 mL 注射器	Becton Dickinson (BD)	309604
BD Precisionglide 针头，25G	Becton Dickinson (BD)	305124
细胞培养皿 35 mm × 10 mm	Cellstar	627 160
细胞培养瓶	Cellstar	660175
盖玻片：12 mm 圆形	Fisherbrand	12-545-80
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）	Invitrogen	D1306
D-生物素	J.T. Baker	C272-00
EDTA	Sigma Aldrich	EDS
乙醇，200 证明	Pharmco-AAPER	111000200
Falcon 100 mm × 15 mm 非 TC 处理聚苯乙烯培养皿	Corning	351029
胎牛血清	Seradigm	1500-500
Ficoll400	Sigma Aldrich	F8016
荧光显微镜	Nikon	E200
山羊抗小鼠 IgG Texas red	Invitrogen	T-862
山羊抗兔 IgG AlexaFluor488	Invitrogen	A-11034
血红素	Tokyo Chemical Industry Co. LTD	H0008
HEPES（1 M）	Gibco	15630-080
Isoton II 稀释液	Beckman Coulter	8546719
L-谷氨酰胺	Gemini	400-106
Medium 199（10×）	Gibco	11825-015
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	11360-070
多聚甲醛	Alfa Aesar	43368
青霉素/链霉素	Gemini	400-109
磷酸盐缓冲液（-/-）	ThermoFisher	14200166
聚丙烯圆锥形离心管 15 mL	Cellstar	188 271
聚丙烯圆锥形离心管 50 mL	Cellstar	227 261
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36930
大鼠抗小鼠 Lamp-1 抗体	发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）	1D4B
重组人 M-CSF	PeproTech	300-25
Reichert Bright-Line 血细胞计数板	Hausser Scientific	1492
RPMI 1640 培养基（1×）	Gibco	11875-093
表面活性剂 Triton X-100	Millipore Sigma	TX1568-1
台盼蓝	Sigma Aldrich	T8154
精细剪刀，4 1/2"	VWR	82027-582
解剖镊，细尖头	VWR	82027-386
显微镜载玻片	VWR	16004-368
Z1 库尔特颗粒计数器，双阈值	Beckman Coulter	6605699