通过显微注射致病菌建立胃类器官感染模型

摘要

来源：Bartfeld, S. 等. 类器官作为感染性疾病的模型：人和小鼠胃类器官的培养及幽门螺杆菌的显微注射. J. Vis. Exp.(2015)。

本视频展示了一种通过将胃部病原体Helicobacter pylori微量注射到类器官腔内，建立胃类器官感染模型的方法。该模型有助于研究感染诱导的胃细胞变化。

方案

1. 类器官培养物的传代

1. 向孔中的基质胶中加入 1 ml 冷的基础培养基。使用 1 ml 微量移液器，剧烈吹打直至基质胶完全破碎，然后转移至 15 ml 离心管中。置于冰上。
2. 用移液器吸取类器官，剧烈吹打 10 次。可通过肉眼观察到类器官的破碎情况。

2. 类器官培养物的显微注射。

注意：本方案可用于将细菌显微注射至类器官中。建议开始注射时选用对显微注射通透性较高的类器官。例如，小鼠胃类器官可生长为体积较大的囊状类器官，易于靶向操作。

1. 材料准备
   1. 根据制造商的建议，使用微量移液器拉制仪将玻璃毛细管拉制成两根注射针。微量移液器拉制仪会在玻璃毛细管中部加热，并将其拉断为两部分，从而生成两根玻璃针。建议同时拉制多根针头，并将其保存在洁净的培养皿中备用。
   2. 为允许细菌感染，需至少经过三次换液（即一周时间）去除所有培养基中的抗生素，以稀释基底膜基质中的抗生素残留。若使用对特定抗生素具有抗性的菌株，可添加该特定抗生素以降低污染风险。
   3. 准备显微注射工作台。在不同生物安全等级下操作时，可能需要将体视显微镜置于无菌操作台内。本实验方案中，在无菌操作台内的体视显微镜下，于生物安全二级条件下注射H. pylori。
   4. 按照标准操作流程培养细菌。
   5. 为估算感染复数（MOI），需测定以下两个参数：感染液中细菌数量及每个类器官中的细胞数量，具体方法如下所述。MOI可能与实验结果相关，例如宿主IL-8 mRNA的表达水平。
      1. 为计算感染液中的细菌密度，首先根据标准操作流程建立光密度与菌落形成单位（CFU）之间的标准曲线。在550 nm波长下，光密度值为0.1时，应约为10⁷ CFU/ml。
      2. 为估算每个类器官中的细胞数量，先计数一个孔中的类器官数量。按照步骤1.1–1.4所述方法解离类器官。在200 × g、4 °C条件下离心5分钟后，加入1 ml酶解解离液并重悬。
         1. 在37 °C孵育5–10分钟，并反复震荡。在显微镜下（如Leica DMIL倒置显微镜，10倍物镜）观察细胞是否已解离为单细胞。如有必要，可延长孵育时间。
         2. 使用血细胞计数板计数每个类器官的细胞数，并计算平均值。直径约为200 µm的人胃类器官约含有4,000个细胞。注射0.2 µl浓度为1 × 10⁹ 细菌/ml的菌液，可获得约50的MOI。
2. 类器官注射
   注意：进行显微注射时，玻璃针固定于持针器中，并通过显微操作仪在三维空间内进行操控。类器官仍保留在孔板中的基底膜基质内。由于尺寸和位置限制，并非所有类器官均适合注射。通常，一个孔中最大的30个类器官可在5分钟内完成注射。
   1. 按照标准操作流程收集细菌，并用基础培养基洗涤。
   2. 根据光密度值计算每毫升细菌数量（见步骤2.1.5.1）。将细菌用基础培养基稀释至1 × 10⁹ 细菌/ml。
   3. 取一根玻璃针，用镊子轻折针尖，使开口直径约为10 µm。
   4. 将针插入注射持针器，并固定于显微操作仪上。
   5. 用针吸取约10 µl细菌溶液。
   6. 将含有类器官培养物的低壁4孔板置于体视显微镜下。
   7. 通过显微操作仪移动针头，对准单个类器官。将针头靠近类器官后，迅速将其插入类器官内部，并使用显微注射仪向每个类器官注射约0.2 µl细菌溶液。

3. 收获类器官用于任何分析。

1. 例如，在培养4小时后固定类器官。移除上清液，加入1 ml 2%甲醛，在室温下孵育20分钟，或在4 °C下过夜。类器官可按照标准操作流程进行免疫组织化学处理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基
HEPES	Invitrogen	15630-056
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
Matrigel, GFR, 无酚红	BD	356231
GlutaMAX	Invitrogen	35050-079	储存液浓度 200 mM，终浓度 2 mM
B27	Invitrogen	17504-044	储存液浓度 50 x，终浓度 1x
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165-5G	储存液浓度 500 mM，终浓度 1 mM
小鼠重组 EGF	Invitrogen	PMG8043	储存液浓度 500 µg/ml，终浓度 50 ng/ml
人重组 FGF10	Peprotech	100-26	储存液浓度 100 µg/ml，终浓度 200 ng/ml
镊子	Neolabs	2-1033	尖端精细的镊子有助于去除组织上的肌层。
4 孔培养板	Thermo Scientific	144444	可使用其他类型的多孔培养板。此类培养板特别适用于显微注射，因其外缘较低，便于操作器移动。
显微注射仪	Narishige	IM-5B
体视显微镜	Leica	MZ75
微量移液器拉制仪	Sutter Instruments	Flaming Brown Micropipette Puller
抗 Cag A 抗体	Santa Cruz	sc-25766