来源：Martinez, E. 等 生成与多表型高内涵筛选 Coxiella burnetii 转座子突变体 视频实验杂志 (2015)
本视频展示了一种评估GFP标记的Coxiella突变株在培养的上皮细胞内生长能力的方法。通过免疫染色和落射荧光显微镜观察突变表型，从而研究突变对细胞内生长的影响。
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方法文章
真核细胞内Coxiella突变株胞内生长能力的评估
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 产生绿色荧光蛋白GFP标记的 Coxiella 转座子突变体文库
在符合当地规定的生物安全二级（BSL-2） containment 条件下，在微生物安全柜（MSC）中操作 Coxiella burnetii RSA439 NMII。若所用细菌模型允许，重复步骤 1.4.1 至 1.4.4，以提高获得克隆突变株的概率。典型的突变体文库所包含的突变体数量（至少）应等于该生物基因组中注释的编码序列数目的三倍。
- 制备电转感受态的 Coxiella RSA439 NMII：
- 制备1×酸化柠檬酸盐半胱氨酸培养基-2（ACCM-2）：13.4 mM 柠檬酸，16.1 mM 柠檬酸钠，3.67 mM 磷酸钾，1 mM 氯化镁，0.02 mM 氯化钙，0.01 mM 硫酸亚铁，125.4 mM 氯化钠，1.5 mM L-半胱氨酸，0.1 g/L Bacto Neopeptone，2.5 g/L 氨基酸混合物（casamino acids），1 g/L 甲基-β-环糊精，125 ml/L Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基。调节pH至4.75，过滤除菌（不可高压灭菌）。
注意： 液态 ACCM-2 在 4 °C 下可稳定保存约 1 个月。....
- 制备1×酸化柠檬酸盐半胱氨酸培养基-2（ACCM-2）：13.4 mM 柠檬酸，16.1 mM 柠檬酸钠，3.67 mM 磷酸钾，1 mM 氯化镁，0.02 mM 氯化钙，0.01 mM 硫酸亚铁，125.4 mM 氯化钠，1.5 mM L-半胱氨酸，0.1 g/L Bacto Neopeptone，2.5 g/L 氨基酸混合物（casamino acids），1 g/L 甲基-β-环糊精，125 ml/L Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基。调节pH至4.75，过滤除菌（不可高压灭菌）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 柠檬酸 | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 培养基组分 |
| 柠檬酸钠 | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 培养基组分 |
| 磷酸钾 | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 培养基组分 |
| 氯化镁 | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 培养基组分 |
| 氯化钙 | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 培养基组分 |
| 硫酸亚铁 | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 培养基组分 |
| 氯化钠 | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 培养基组分 |
| L-半胱氨酸 | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 培养基组分 |
| Bacto 新蛋白胨 | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 培养基组分 |
| 酪蛋白氨基酸 | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 培养基组分 |
| 甲基-β-环糊精 | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 培养基组分 |
| RPMI 含谷氨酰胺 | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 培养基组分 |
| RPMI 含谷氨酰胺，不含酚红 | Gibco | 32404-014 | 用于细胞培养与感染 |
| 胎牛血清 | GE healthcare | SH30071 | 用于细胞培养 |
| 胰蛋白酶 EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | 用于细胞培养 |
| 皂苷 | Sigma | 47036 | 用于免疫荧光染色 |
| 氯化铵 | Sigma | A9434 | 用于免疫荧光染色 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2153 | 用于免疫荧光染色 |
| 电穿孔比色皿 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | 用于考克斯体转化 |
| Trackmates 螺口管带盖 | Thermo Scientific | 3741 | 二维条形码螺口盖 |
| 96孔微孔板，黑色壁与底部 | Greiner | 655076 | 平底暗底，用于双链DNA定量 |
| 96孔微孔板，透明，黑色壁 | Greiner | 655090 | 平底透明底，用于细胞培养与成像 |
| 96孔PCR微孔板 | Biorad | 2239441 | 无DNA酶/RNA酶 |
| 96孔深孔板 | Labcon | 949481 | 用于考克斯体突变株感染 |
| PicoGreen | Life Technologies | P7581 | 用于双链DNA定量 |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | 用于双链DNA定量 |
| Phusion 高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | M0530L | 用于单引物菌落PCR |
| Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | 用于成像 |
| 抗LAMP1抗体 | Sigma | 94403-1ML | 用于免疫荧光染色 |
| Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | 用于成像 |
| 荧光微孔板读板仪 Infinite 200 Pro | Tecan | ||
| 落射荧光自动显微镜 Cellomics | Thermo Scientific |
