真核细胞内Coxiella突变株胞内生长能力的评估

摘要

来源：Martinez, E. 等 生成与多表型高内涵筛选 Coxiella burnetii 转座子突变体 视频实验杂志 (2015)

本视频展示了一种评估GFP标记的Coxiella突变株在培养的上皮细胞内生长能力的方法。通过免疫染色和落射荧光显微镜观察突变表型，从而研究突变对细胞内生长的影响。

方案

1. 产生绿色荧光蛋白GFP标记的 Coxiella 转座子突变体文库

在符合当地规定的生物安全二级（BSL-2） containment 条件下，在微生物安全柜（MSC）中操作 Coxiella burnetii RSA439 NMII。若所用细菌模型允许，重复步骤 1.4.1 至 1.4.4，以提高获得克隆突变株的概率。典型的突变体文库所包含的突变体数量（至少）应等于该生物基因组中注释的编码序列数目的三倍。

1. 制备电转感受态的 Coxiella RSA439 NMII：
   1. 制备1×酸化柠檬酸盐半胱氨酸培养基-2（ACCM-2）：13.4 mM 柠檬酸，16.1 mM 柠檬酸钠，3.67 mM 磷酸钾，1 mM 氯化镁，0.02 mM 氯化钙，0.01 mM 硫酸亚铁，125.4 mM 氯化钠，1.5 mM L-半胱氨酸，0.1 g/L Bacto Neopeptone，2.5 g/L 氨基酸混合物（casamino acids），1 g/L 甲基-β-环糊精，125 ml/L Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基。调节pH至4.75，过滤除菌（不可高压灭菌）。
      注意： 液态 ACCM-2 在 4 °C 下可稳定保存约 1 个月。
   2. 接种 2 x 10 的菌液至 100 ml ACCM-2 培养基中⁶ 基因组当量（GE）/毫升 柯克斯体 RSA439 NMII（来自步骤1.5中 previously 生成并定量的细菌菌种）从-80 °C保存管中取出，并将细菌悬液分装至75 cm²培养瓶中² 带透气盖的细胞培养瓶（每瓶10 - 15 ml细菌悬液）。在37 °C、含5%二氧化碳（CO₂）的湿润环境中培养7天。₂) 和2.5%氧气（O₂).
   3. 将所得的细菌悬液汇集至50 ml离心管中，于3,900 x g 4 °C 下孵育 1 小时。
   4. 弃去上清液，将沉淀重悬于 30 ml 10% 甘油中。在 3,900 x g 4 °C 下孵育 1 小时。
   5. 将菌体重悬于适量体积的10%甘油溶液中（通常为2 ml），分装至500 µl离心管中，每管50 µl。整个操作过程中，将重悬的细菌置于冰上保存。
      注意： 此时，细菌已具备电转化能力，每份 aliquot 足以进行一次电转化。细菌悬液可于 -80 °C 保存 6 个月，或直接用于质粒脱氧核糖核酸（DNA）的电转化。
2. 将编码转座子和转座酶的质粒电穿孔转化至感受态柯克斯体中：
   1. 将0.1 cm电穿孔比色皿置于冰上预冷10分钟。将50 µl感受态细胞与待转化材料混合。 Coxiella 使用10 µg转座子质粒和10 µg转座酶质粒。确保质粒浓度高于500 µg/ml，以尽量减少对甘油的稀释。
   2. 使用以下参数进行电穿孔：18 kV，500 Ω，25 µF。确保所得时间常数在9至13毫秒之间。
   3. 立即加入950 µl RPMI培养基，重悬电穿孔后的细菌，转移至螺口管中，并于室温下保存。
   4. 取200 µl电转化后的细菌，加入含有1%热灭活胎牛血清（FBS）的ACCM-2培养基3 ml，接种于6孔板中。向剩余体积的电转化细菌中加入88 µl二甲基亚砜（DMSO），使DMSO终浓度为10%，并于-80 °C保存。
      注意： 在以下实验方案中，转座元件和转座酶分别由两种不同的质粒编码（pITR-CAT-GFP 和 pUC19-Himar1C9）。这两种质粒均缺乏专属于柯克斯体（Coxiella）的复制起点，因此在电穿孔转入柯克斯体后成为自杀型质粒，从而确保转座子插入的稳定性。转座元件包含一个氯霉素抗性盒（CAT），其表达受柯克斯体启动子 p1169 调控，用于筛选；此外还包含 gfp 基因，其表达受柯克斯体启动子 p311 调控，用于使所获得的突变株标记上绿色荧光蛋白（GFP）。
3. 转座子突变体的筛选：
   1. 将按上述方法（1.2.4）接种的6孔板在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育过夜₂ 和 2.5% O₂₂加入适当的抗生素（375 µg/ml 卡那霉素或 3 µg/ml 氯霉素）。在上述条件下，将细菌培养物继续孵育 3 天。
4. 分离单个突变体：
   1. ACCM-2 固体平板的制备与接种 Coxiella 转座子突变体
      注意： 以下说明适用于1个培养皿，需测试细菌培养物的多个稀释度，以确定用于菌落分离的最佳接种体积。
      1. 将10.5 ml的0.5%琼脂糖在微波炉中加热溶解，随后置于55 °C水浴中冷却。将11.25 ml的2x ACCM-2（pH 4.75）在37 °C加热。
      2. 制备底层琼脂糖：
         1. 将10 ml融化的0.5%琼脂糖与10 ml 2x ACCM-2混合，并加入适当的抗生素（375 µg/ml卡那霉素或3 µg/ml氯霉素）。
         2. 立即倒入培养皿中。保持培养皿无盖，让培养基冷却30分钟，再风干20分钟。
      3. 制备顶层琼脂糖：
         1. 在5 ml聚苯乙烯管中，将1.25 ml 2x ACCM-2与0.75 ml水混合，加入适当的抗生素（375 µg/ml卡那霉素或3 µg/ml氯霉素），于37 °C培养。
         2. 加入细菌培养物（通常为1至100 µl），涡旋振荡5秒。
         3. 加入0.5 ml融化的琼脂糖，混匀，立即铺在底层琼脂糖上。
         4. 静置冷却20分钟，盖上培养皿盖，于4 °C孵育20分钟，以促进琼脂糖凝固。
         5. 在生物安全柜中敞盖风干20分钟。将培养板置于37 °C、5% CO₂的湿化环境中培养。₂ 和 2.5% O₂ 6至7天。
   2. 向剩余的细菌培养物中加入DMSO，使其终浓度为10% DMSO，于-80 °C保存。
   3. 按照以下方法确定最佳稀释度：确保菌落直径为0.5至1 mm，并充分分离，以避免交叉污染。将1.4.2步骤中剩余的细菌培养物解冻，并按照1.4.1.2和1.4.1.3所述方法，在ACCM-2琼脂平板上进行适当稀释后涂布。按照1.4.1.3.5所述条件孵育6至7天。
   4. 当菌落可见时，用剪去尖端的1 ml吸头挑取含有单菌落的琼脂块，并将其在24孔板中加入含适当抗生素（375 µg/ml 卡那霉素或3 µg/ml 氯霉素）的1.5 ml ACCM-2培养基中吹打分散。在1.3.1节所述条件下，对单个菌落进行6天扩增培养。培养第3天，通过吹打使各孔中的细菌团块分散。
   5. 将每种突变体悬液分装至带二维条形码螺旋盖管中，置于96孔板内，加入10% DMSO，于-80 °C保存。
5. 细菌浓度评估：    
   注意： 以下方案可用于获得细菌突变体在无菌培养基中复制时的生长曲线（参见1.4.4）。
   1. 标准曲线制备：
      1. 在1×Tris-乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（TE）中配制2 µg/ml的双链DNA（dsDNA）储存液（通常使用已知大小和浓度的随机质粒）。 从原液制备10倍系列稀释液，以获得浓度范围为2 µg/ml至2 ng/ml的溶液。将每种浓度的溶液各50 µl分别加入96孔黑色壁底微孔板的单个孔中（参见 材料表).
      2. 将dsDNA定量试剂用1×TE缓冲液按1:200稀释，向96孔微孔板中每个样品加入55 µl稀释后的试剂。使用板式振荡器充分混匀，室温避光孵育2至5分钟。
      3. 使用荧光酶标仪和标准荧光素波长的滤光片（激发波长约480 nm，发射波长约520 nm）测定样品的荧光。
      4. 将质粒浓度范围对荧光强度读数作图。
   2. 细菌悬液定量：
      1. 在96孔黑色壁底微孔板中，每孔加入5 µl 10% Triton X-100（参见 材料表加入50 µl细菌悬液至各孔中，在室温下于平板振荡器上孵育10分钟。
      2. 将dsDNA定量试剂用1×TE缓冲液按1:200稀释，向96孔微孔板中每个样品加入55 µl稀释后的试剂。使用板式振荡器充分混匀，室温避光孵育2至5分钟。
      3. 使用荧光酶标仪和标准荧光素波长的滤光片（激发波长约480 nm，发射波长约520 nm）测定样品的荧光。
      4. 为获得细菌DNA浓度，绘制1.5.1.4步骤中所得图表的荧光读数。将DNA浓度除以样品质量 Coxiella 基因组（2.2 fg）以获得细菌浓度。结果以基因组当量/mL表示。
      5. 弃除在 ACCM-2 中表现出显著生长缺陷的突变株。

2. 单引物菌落聚合酶链式反应（PCR）、测序与注释

注意：以下方案适用于96个样品的DNA扩增，建议在后续步骤中使用多通道移液器。使用磁珠进行PCR产物的柱纯化以及利用转座子特异性引物（2.3）进行DNA测序，已外包给外部公司完成。

1. 设计扩增引物，使其在反向串联重复序列（ITR）上游100至200个碱基对之间发生杂交，以获得覆盖转座子插入位点的PCR产物，该位点位于 Coxiella 基因组上。准备3 ml PCR反应混合液（1×高保真缓冲液、200 µM脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、1 µM扩增引物、20 U/ml高保真DNA聚合酶），并将29 µl PCR混合液分装至置于冰上的96孔PCR板的每个孔中。将每种处于稳定期的突变株1 µl转移至ACCM-2培养基中的PCR混合液中。
2. 进行PCR扩增，程序如下：初始变性（98 °C，1 min）；20个高严谨性循环（98 °C，10 sec；50 °C，30 sec；72 °C，90 sec）；30个低严谨性循环（98 °C，10 sec；30 °C，30 sec；72 °C，90 sec）；再进行30个高严谨性循环（98 °C，10 sec；50 °C，30 sec；72 °C，90 sec），最后在72 °C延伸7 min。
3. 使用磁珠纯化PCR产物，并用转座子特异性引物进行DNA测序。设计转座子特异性引物时，其预测熔解温度应在50°C至75°C之间，GC含量在40%至60%之间，长度为18至25个核苷酸，退火位点应位于扩增引物杂交位点的下游，且距离转座子ITR的第一个碱基对至少上游100个碱基对。
4. 使用序列分析软件加载Coxiella burnetii 493 NMI的完整注释基因组。利用“比对至参考序列”功能加载并比对（blastn）测序结果，以确定转座位点。剔除测序结果不匹配和/或出现双峰读数的突变株。为监测突变文库的饱和度，记录相同位点发生多个转座子插入的情况。

3. 使用 Coxiella 突变株感染真核细胞及胞内生长的监测

注意：建议使用多通道移液器进行以下步骤。感染实验在无菌的96孔黑色壁透明平底微孔板中以三复孔形式进行。表达GFP的野生型 Coxiella burnetii  由Robert Heinzen博士提供。

1. 在不含酚红并添加10%胎牛血清（FBS）且不含抗生素的RPMI培养基（完全RPMI培养基）中培养Vero细胞。
2. 感染前一天，用10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）清洗汇合或亚汇合状态的Vero细胞培养瓶。
3. 向细胞培养瓶中加入1 ml胰蛋白酶EDTA溶液，于37 °C、5% CO₂的湿润环境中孵育3至5分钟，使Vero细胞脱落。
4. 将细胞重悬于10 ml完全RPMI培养基中。计数细胞，并制备浓度为每毫升10⁵ 个细胞的细胞悬液。
5. 向每孔加入100 µl细胞悬液至平底透明黑色96孔板的各个孔中。
6. 室温（RT）下以400 × g离心5分钟，以促进细胞贴附于孔底，随后在37 °C、5% CO₂的湿润环境中过夜孵育。
7. 将含有 Coxiella 突变株的96孔板在室温下解冻，并在深孔96孔板中将150 µl细菌悬液用300 µl不含酚红和FBS的RPMI培养基稀释。
8. 移除含有Vero细胞的微孔板中的培养基，每孔加入100 µl稀释后的 Coxiella 突变株（感染复数MOI为100）。以A1孔作为阴性（未感染细胞）对照，A2和A3孔作为阳性对照（分别以MOI为100和200感染表达GFP 的野生型 Coxiella 的细胞）。
9. 使用防气溶胶的离心板架，在室温下以400 × g对微孔板离心10分钟。
10. 在37 °C、5% CO₂ 的湿润环境中孵育2小时，然后将含细菌的培养基更换为每孔100 µl新鲜的完全RPMI培养基。
11. 使用荧光酶标仪及标准荧光素波长滤光片（激发波长约480 nm，发射波长约520 nm）每天检测一次GFP荧光强度，连续检测7天。为避免培养基中冷凝水和信号散射造成的干扰，应采用酶标仪的底部激发和底部检测模式进行读数。

4. 自动化图像采集样品的制备

注意：该步骤适用于一个 96 孔板，相应扩大体积。第 4.2 步骤可使用洗板机进行操作。

1. 第7天^th 感染后第1天，移除培养板中的培养基，每孔加入50 µl含适当稀释度细胞通透性荧光染料的新鲜完全培养基（通常稀释比例为1:1,000，可根据所用细胞系进行优化）。将细胞置于37 °C、5% CO₂的湿润环境中孵育30–60分钟。₂.
2. 用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液替换培养基，每孔50 µl，室温孵育30分钟，随后吸除含PFA的溶液，并用PBS洗涤3次。
3. 移除 PBS，每孔加入 50 µl 封闭液（0.5% 牛血清白蛋白，50 mM 氯化铵，NH₄Cl 在含 0.05% 皂苷的 PBS（pH 7.4）中。室温孵育 30 分钟。
4. 用 40 µl/孔的新鲜封闭液（含皂苷，同上）替换封闭液，并加入 1:500 稀释的抗溶酶体相关膜糖蛋白-1（抗-LAMP1）抗体。室温孵育 30 分钟。
5. 移除封闭液，用 PBS 每孔 100 µl 洗涤 96 孔板 5 次。
6. 每孔加入40 µl封闭液，其中添加皂苷（同上）、适宜的荧光标记二抗（1:1,000稀释）以显色第4.4步中使用的抗LAMP1抗体，以及5 µg/ml的Hoechst 33258。室温孵育30分钟。
7. 吸除封闭液，用 100 µl/孔的 PBS 洗涤 96 孔板 5 次。最后一次洗涤后，将 PBS 保留在 96 孔板中，避免固定后的细胞干燥。
8. 立即成像，或在4 °C避光保存，以备后续分析。

5. 图像采集

1. 使用配备20倍物镜的落射荧光自动显微镜，在GFP（488 nm，细菌）、Hoechst 33258（350 nm，宿主细胞核）、红色（~555 nm，细胞膜标记物）和远红（~615 nm，LAMP1）通道中采集图像。每孔采集21个独立视野，以确保每个样本至少成像5,000个细胞。以宿主细胞核通道作为参考进行自动对焦。当研究感染宿主细胞比例较低的细菌病原体时，用户可调整每孔采集的独立视野数量，以获得至少500个感染细胞用于分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
柠檬酸	Sigma	C0759-500G	ACCM-2 培养基组分
柠檬酸钠	Sigma	S4641-500G	ACCM-2 培养基组分
磷酸钾	Sigma	60218-100G	ACCM-2 培养基组分
氯化镁	Sigma	M2670-100G	ACCM-2 培养基组分
氯化钙	Sigma	C5080-500G	ACCM-2 培养基组分
硫酸亚铁	Sigma	F8633-250G	ACCM-2 培养基组分
氯化钠	Sigma	S9625-500G	ACCM-2 培养基组分
L-半胱氨酸	Sigma	C6852-25G	ACCM-2 培养基组分
Bacto 新蛋白胨	BD (Beckton-Dickinson)	211681	ACCM-2 培养基组分
酪蛋白氨基酸	BD (Beckton-Dickinson)	223050	ACCM-2 培养基组分
甲基-β-环糊精	Sigma	C4555-10G	ACCM-2 培养基组分
RPMI 含谷氨酰胺	Gibco	61870-010	ACCM-2 培养基组分
RPMI 含谷氨酰胺，不含酚红	Gibco	32404-014	用于细胞培养与感染
胎牛血清	GE healthcare	SH30071	用于细胞培养
胰蛋白酶 EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056	用于细胞培养
皂苷	Sigma	47036	用于免疫荧光染色
氯化铵	Sigma	A9434	用于免疫荧光染色
牛血清白蛋白	Sigma	A2153	用于免疫荧光染色
电穿孔比色皿 0.1 cm	Eurogentec	ce0001-50	用于考克斯体转化
Trackmates 螺口管带盖	Thermo Scientific	3741	二维条形码螺口盖
96孔微孔板，黑色壁与底部	Greiner	655076	平底暗底，用于双链DNA定量
96孔微孔板，透明，黑色壁	Greiner	655090	平底透明底，用于细胞培养与成像
96孔PCR微孔板	Biorad	2239441	无DNA酶/RNA酶
96孔深孔板	Labcon	949481	用于考克斯体突变株感染
PicoGreen	Life Technologies	P7581	用于双链DNA定量
Triton X-100	Sigma	T9284-500ML	用于双链DNA定量
Phusion 高保真DNA聚合酶	New England Biolabs	M0530L	用于单引物菌落PCR
Celltracker Red CMTPX	Life Technologies	C34552	用于成像
抗LAMP1抗体	Sigma	94403-1ML	用于免疫荧光染色
Hoechst 33258	Sigma	L1418	用于成像
荧光微孔板读板仪 Infinite 200 Pro	Tecan
落射荧光自动显微镜 Cellomics	Thermo Scientific