一种用于研究厌氧菌-宿主细胞相互作用的细菌感染检测方法

摘要

来源：Wunsch, C. M., 等 牙龈卟啉单胞菌 作为评估厌氧菌与宿主细胞相互作用的模式生物。 J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了一种评估厌氧致病菌Porphyromonas gingivalis黏附并侵入人脐静脉内皮细胞（HUVECs）能力的技术。在用细菌感染宿主细胞后，裂解宿主细胞以释放黏附和内化于其中的细菌。将裂解液接种至适当的培养基中，若出现菌落，则表明细菌与宿主细胞之间发生了成功的相互作用。

方案

以下方案将描述培养和研究厌氧菌种P. gingivalis侵袭的方法；然而，这些方案也可用于多种其他厌氧致病菌。尽管本方案使用了HUVECs，但也可适用于其他真核细胞，包括免疫性和非免疫性细胞。

1. 厌氧培养箱的使用与维护

注意：P. gingivalis 是一种对空气中正常氧浓度敏感的厌氧菌。培养 P. gingivalis 必须具备可控的厌氧环境。

1. 在此，于乙烯厌氧培养箱内维持一种指定为混合厌氧气体（80% N₂、10% H₂、10% CO₂）的人工环境（图1A）。使用气闸室（图1B）将物品从实验室环境转移至厌氧培养箱内。气闸室需手动操作，在引入混合厌氧气体前，先用N₂气体置换两次。
2. 使用硫化氢去除柱（图1C）以实现无需维护的硫化氢清除。在培养箱内放置除湿器，以去除催化剂反应生成的H₂O，并避免产生促进污染扩散的气溶胶。
   注意：硫化氢是多种厌氧细菌的天然代谢副产物，其积累对细菌具有毒性，并可能导致电子设备损坏以及缩短催化剂寿命。
3. 使用风扇箱将培养箱内的气体循环通过钯催化剂，该催化剂在氢气存在下可去除氧气（图1D）。
   注意：循环空气（高效微粒空气或HEPA）过滤器可去除粒径为0.22 µm或更大的空气传播污染物。
4. 在位于厌氧培养箱内部的37 °C培养箱中培养厌氧细菌。在厌氧培养箱内操作时，应采用标准的无菌技术。

2. 厌氧菌的制备

注意：P. gingivalis 具有耐氧性，可在有氧条件下保存，但在氧气浓度高于6%的环境中无法生长。培养 P. gingivalis 及其他厌氧菌时必须使用厌氧培养箱（图1）。在操作微需氧菌之前，必须接受关于厌氧培养箱使用的适当培训与教育。

1. 在实验前至少12小时，将所有液体培养基和培养板置于厌氧条件下平衡，以去除残留的氧气。
2. 将 P. gingivalis 从-80 °C冰箱转移至厌氧工作站，并使其解冻。
3. 用胰蛋白酶大豆血琼脂平板（TSA II，含5%绵羊血）划线接种 P. gingivalis。用Parafilm封膜后，于37 °C厌氧培养箱中培养4–7天。
4. 使用无菌接种环将 P. gingivalis 接种至3 ml 添加血红素和甲萘醌的脑心浸液（BHI）液体培养基中，该培养基为富集型非选择性培养基，适用于厌氧菌和苛养微生物的分离与培养。
   注意： 长期保存时，将BHI培养的菌液与甘油或DMSO混合（终浓度为10–20%），置于-80 °C冰箱保存。
5. 通过1:10稀释制备 P. gingivalis 的种子培养物，并使细菌生长至对数中期。

注意：需测定细菌悬液的光密度，并调整待检测各菌株的细菌浓度。对于牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis），OD₆₆₀ 为 0.7 的菌悬液对应于对数生长中期，细菌浓度约为 7 × 10⁸ 个细胞/毫升。上述方案中描述的培养条件专用于牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis），其他细菌菌株可能需要进行相应调整。

3. 内皮细胞培养

注意：购买混合的原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs），并按照生产商说明书在含有血管内皮生长因子（VEGF）的基础培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下进行培养。

1. 在15 ml VEGF培养基中，以每瓶2.5 × 10⁵个细胞的密度将HUVECs接种于T-75培养瓶中。
   注意：通过与4.0%台盼蓝按1:1比例稀释来检测细胞活力。细胞膜受损的细胞会摄取台盼蓝，而在双目光学显微镜下观察时，膜完整的健康细胞则呈无色。计数100个细胞，确保存活细胞比例超过80%。
2. 每隔2天更换一次预热的新鲜VEGF培养基，直至细胞融合度达到约80%。
3. 用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。加入2 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，孵育5分钟，使细胞从T-75培养瓶中脱落，随后加入2 ml胰蛋白酶中和液终止消化。
4. 将悬浮的HUVECs收集至50 ml锥形管中。用PBS冲洗T-75培养瓶中残留的细胞，并转移至50 ml锥形管中。
5. 以200 × g离心10分钟。
6. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml预热的VEGF培养基中。
7. 使用血细胞计数板或类似的细胞计数装置测定细胞浓度。
8. 根据细胞悬液浓度计算所需添加量，接种至6孔板（每孔400,000个细胞）或含盖玻片的12孔板（每孔50,000个细胞）。HUVECs将于次日准备好用于实验。

4. 存活率检测侵袭/相互作用（铺板）

注意： 进行本实验时，准备两块6孔板，每孔接种400,000个内皮细胞。其中一块用于评估与宿主细胞结合并被其内化的细菌，另一块用于计数胞内细菌。使用6孔板可在一次实验中对两个样本进行三重复测定。有关本方案的流程概要，请参见存活率实验流程图（图2）。

1. 按照上述方法（见第1节）制备厌氧细菌，使其生长至对数中期（OD₆₆₀ 0.5-0.7).
2. 在5,000 × g条件下离心细菌10分钟。
   注意：如果离心机位于厌氧舱外，应将细菌样品置于密封良好的15 ml离心管中，并用帕拉膜（parafilm）包裹管盖，以防止氧气渗入。
3. 放置沉淀物 P. gingivalis 回到离心管中，弃去上清液。用PBS洗涤，再次离心收集菌体，然后重悬于VEGF培养基中。将所有待测菌株分别制备成OD₆₆₀ 0.7，对应于对数生长中期（约7 × 10）⁸ 细胞/ml）。细菌现已准备好用于感染实验。
4. 将含有 HUVECs 的 6 孔板从组织培养孵箱转移至厌氧室中。吸除培养基，用厌氧 PBS 洗涤 3 次。每孔加入 2 ml 厌氧 VEGF 培养基，将培养板置于 37 °C 厌氧孵箱中孵育 20 分钟，使温度平衡，为感染做准备。
   注意： 在血琼脂平板上接种细菌，以确保用于感染的菌株具有均一性且未受污染。
5. 以感染复数（MOI 细菌:宿主细胞）100:1 的比例用细菌感染宿主细胞。
   注意： 通过在感染前对单个孔进行台盼蓝排斥实验来确定 HUVEC 细胞数量。细菌细胞数量通过光密度（例如， OD 为 0.5 = 5 × 10⁸ 细胞/ml）。根据 HUVEC 的浓度将细菌浓度调整至适当的 MOI。
6. 将感染的HUVECs置于6孔板中，放入厌氧培养箱，使细菌与宿主细胞相互作用30分钟。
7. 在厌氧舱内用BHI（1.0% w/v）配制皂苷溶液，并通过0.2 µm滤膜过滤。
8. 附着和内化细菌的存活率
   1. 从培养箱中取出培养板，吸除培养基，用厌氧 PBS 洗涤三次，加入 2 ml 过滤后的 1.0% 皂苷溶液（按步骤 4.8 所述方法配制）。孵育 15 分钟，使宿主细胞裂解。
   2. 用细胞刮刀刮取每个孔底部的细胞。收集每个孔中的细胞混合物，并用BHI进行1:1稀释。
   3. 继续对样品进行连续稀释。根据细菌种类和浓度，调整稀释倍数。可从1:100或1:1,000的稀释度开始。
   4. 将所需稀释度的菌液取200 µl接种于血琼脂平板上。用封口膜包裹平板，并置于37 °C厌氧培养箱中培养。
   5. 在37 °C下孵育7天后，取出培养皿，使用光源箱手动计数菌落形成单位（CFUs）。
      注意： 对菌落形成单位（CFUs）进行计数。当菌落形成单位数量较多时，可拍摄图像并使用计算机软件辅助完成菌落计数。

结果

图1. 厌氧乙烯基舱及其组件。（A）一个完全与大气氧隔离的乙烯基厌氧舱，可同时为两人提供操作空间（32 英寸 × 78 英寸）。舱内配有设定在 37 °C 的培养箱（后中部）。（B）气闸室用于将物品从实验室环境转移至厌氧舱内。图示为一个通过控制器操作的自动气闸室，可编程自动执行创建厌氧环境所需的抽真空和吹扫程序。（C）硫化氢去除柱可无需维护地高效去除有害的硫化氢。（D）两个催化剂风扇箱分布在厌氧舱内部，用于促进舱内气体通过钯催化剂循环，在氢气存在下除去氧气。厌氧舱的设置依照制造商的说明进行。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙烯厌氧培养箱-型号B	Coy Laboratory Products		Model 2000 培养箱
含5%绵羊血的TSA II胰蛋白酶大豆琼脂	BBL	221261
人脐静脉内皮细胞（10名供体混合样本）	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF完全培养基试剂盒	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
皂苷	Riedel-de Haen	16109