来源:Wunsch, C. M., 等 牙龈卟啉单胞菌 作为评估厌氧菌与宿主细胞相互作用的模式生物。 J. Vis. Exp. (2015)
本视频演示了一种评估厌氧致病菌Porphyromonas gingivalis黏附并侵入人脐静脉内皮细胞(HUVECs)能力的技术。在用细菌感染宿主细胞后,裂解宿主细胞以释放黏附和内化于其中的细菌。将裂解液接种至适当的培养基中,若出现菌落,则表明细菌与宿主细胞之间发生了成功的相互作用。
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2025年7月8日
来源:Wunsch, C. M., 等 牙龈卟啉单胞菌 作为评估厌氧菌与宿主细胞相互作用的模式生物。 J. Vis. Exp. (2015)
本视频演示了一种评估厌氧致病菌Porphyromonas gingivalis黏附并侵入人脐静脉内皮细胞(HUVECs)能力的技术。在用细菌感染宿主细胞后,裂解宿主细胞以释放黏附和内化于其中的细菌。将裂解液接种至适当的培养基中,若出现菌落,则表明细菌与宿主细胞之间发生了成功的相互作用。
以下方案将描述培养和研究厌氧菌种P. gingivalis侵袭的方法;然而,这些方案也可用于多种其他厌氧致病菌。尽管本方案使用了HUVECs,但也可适用于其他真核细胞,包括免疫性和非免疫性细胞。
1. 厌氧培养箱的使用与维护
注意:P. gingivalis 是一种对空气中正常氧浓度敏感的厌氧菌。培养 P. gingivalis 必须具备可控的厌氧环境。
2. 厌氧菌的制备
注意:P. gingivalis 具有耐氧性,可在有氧条件下保存,但在氧气浓度高于6%的环境中无法生长。培养 P. gingivalis 及其他厌氧菌时必须使用厌氧培养箱(图1)。在操作微需氧菌之前,必须接受关于厌氧培养箱使用的适当培训与教育。
注意:需测定细菌悬液的光密度,并调整待检测各菌株的细菌浓度。对于牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis),OD660 为 0.7 的菌悬液对应于对数生长中期,细菌浓度约为 7 × 108 个细胞/毫升。上述方案中描述的培养条件专用于牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis),其他细菌菌株可能需要进行相应调整。
3. 内皮细胞培养
注意:购买混合的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs),并按照生产商说明书在含有血管内皮生长因子(VEGF)的基础培养基中,于37 °C、5% CO2条件下进行培养。
4. 存活率检测侵袭/相互作用(铺板)
注意: 进行本实验时,准备两块6孔板,每孔接种400,000个内皮细胞。其中一块用于评估与宿主细胞结合并被其内化的细菌,另一块用于计数胞内细菌。使用6孔板可在一次实验中对两个样本进行三重复测定。有关本方案的流程概要,请参见存活率实验流程图(图2)。
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图1. 厌氧乙烯基舱及其组件。(A)一个完全与大气氧隔离的乙烯基厌氧舱,可同时为两人提供操作空间(32 英寸 × 78 英寸)。舱内配有设定在 37 °C 的培养箱(后中部)。(B)气闸室用于将物品从实验室环境转移至厌氧舱内。图示为一个通过控制器操作的自动气闸室,可编程自动执行创建厌氧环境所需的抽真空和吹扫程序。(C)硫化氢去除柱可无需维护地高效去除有害的硫化氢。(D)两个催化剂风扇箱分布在厌氧舱内部,用于促进舱内气体通过钯催化剂循环,在氢气存在下除去氧气。厌氧舱的设置依照制造商的说明进行。
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| 乙烯厌氧培养箱-型号B | Coy Laboratory Products | Model 2000 培养箱 | |
| 含5%绵羊血的TSA II胰蛋白酶大豆琼脂 | BBL | 221261 | |
| 人脐静脉内皮细胞(10名供体混合样本) | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF完全培养基试剂盒 | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| 皂苷 | Riedel-de Haen | 16109 |