可视化宿主内皮细胞内吞的厌氧细菌

摘要

来源：Wunsch, C. M. 等人， 牙龈卟啉单胞菌 作为评估厌氧菌与宿主细胞相互作用的模式生物。 视频实验期刊. (2015)

在本视频中，我们演示了一种利用共聚焦显微镜观察厌氧致病菌Porphyromonas gingivalis在人血管内皮细胞内吞过程的实验方法。实验中，细菌用一种荧光染料进行标记，而宿主内皮细胞的肌动蛋白细胞骨架则用另一种荧光染料进行标记。通过共聚焦显微镜可清晰观察到内化于内皮细胞内的Porphyromonas gingivalis。

方案

1. 细菌侵入宿主细胞（荧光显微镜法）

注意：P. gingivalis 用 2',7'-双(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧基甲酯（BCECF-AM）进行标记。BCECF-AM 是一种非荧光、可穿透细胞膜的染料；其在细胞内酯酶的作用下转化为荧光素 BCECF，可指示细胞活力。P. gingivalis 经 BCECF-AM 染色后用于感染真核细胞。感染后，细胞经固定并用 DAPI 和 TRITC-鬼笔环肽染色。用于染色真核细胞核的 DAPI 也可标记细菌的细胞核，从而提供一种识别无法代谢裂解 BCECF-AM 的非活性细菌的对照方法。宿主细胞用 TRITC-鬼笔环肽（一种红色肌动蛋白染料）进行标记。

1. 高压灭菌盖玻片。在接种内皮细胞前，无菌地将盖玻片加入12孔板中，每孔接种5 × 10⁴ 个细胞。（实验前一天准备）
2. 按照上述方法，将内皮细胞接种于12孔板中的18 mm（#1.5厚度）圆形盖玻片上。
3. 准备处于对数中期生长的厌氧细菌（OD₆₆₀ = 0.5–0.7）。
4. 用厌氧PBS洗涤细菌两次，每次以5,000 × g离心，将菌体沉淀重悬于PBS中，终浓度为5–7 × 10⁸ 个细胞/mL。
5. 向2....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙烯厌氧培养箱-型号B	Coy Laboratory Products		Model 2000 培养箱
含5%羊血的TSA II胰蛋白酶大豆琼脂	BBL	221261
人脐静脉内皮细胞（10名供者混合样本）	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF完全培养基试剂盒	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC鬼笔环肽	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm圆形盖玻片	Electron Microscopy Sciences	72222-01
含DAPI的VectaShield封片剂	Vector Laboratories	H-1200