可视化宿主内皮细胞内吞的厌氧细菌

摘要

来源：Wunsch, C. M. 等人， 牙龈卟啉单胞菌 作为评估厌氧菌与宿主细胞相互作用的模式生物。 视频实验期刊. (2015)

在本视频中，我们演示了一种利用共聚焦显微镜观察厌氧致病菌Porphyromonas gingivalis在人血管内皮细胞内吞过程的实验方法。实验中，细菌用一种荧光染料进行标记，而宿主内皮细胞的肌动蛋白细胞骨架则用另一种荧光染料进行标记。通过共聚焦显微镜可清晰观察到内化于内皮细胞内的Porphyromonas gingivalis。

方案

1. 细菌侵入宿主细胞（荧光显微镜法）

注意：P. gingivalis 用 2',7'-双(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧基甲酯（BCECF-AM）进行标记。BCECF-AM 是一种非荧光、可穿透细胞膜的染料；其在细胞内酯酶的作用下转化为荧光素 BCECF，可指示细胞活力。P. gingivalis 经 BCECF-AM 染色后用于感染真核细胞。感染后，细胞经固定并用 DAPI 和 TRITC-鬼笔环肽染色。用于染色真核细胞核的 DAPI 也可标记细菌的细胞核，从而提供一种识别无法代谢裂解 BCECF-AM 的非活性细菌的对照方法。宿主细胞用 TRITC-鬼笔环肽（一种红色肌动蛋白染料）进行标记。

1. 高压灭菌盖玻片。在接种内皮细胞前，无菌地将盖玻片加入12孔板中，每孔接种5 × 10⁴ 个细胞。（实验前一天准备）
2. 按照上述方法，将内皮细胞接种于12孔板中的18 mm（#1.5厚度）圆形盖玻片上。
3. 准备处于对数中期生长的厌氧细菌（OD₆₆₀ = 0.5–0.7）。
4. 用厌氧PBS洗涤细菌两次，每次以5,000 × g离心，将菌体沉淀重悬于PBS中，终浓度为5–7 × 10⁸ 个细胞/mL。
5. 向2 mL细菌悬液（5–7 × 10⁸ 个细胞/mL）中加入20 µL 0.2 mM BCECF-AM，使BCECF-AM终浓度为2 µM。
6. 在37 °C避光孵育30分钟。
7. 将接种有内皮细胞的18 mm（#1.5厚度）圆形盖玻片的12孔板从组织培养孵箱转移至厌氧舱内，用PBS洗涤，并更换为厌氧VEGF培养基。
   注意：在光学显微镜下确认HUVECs状态良好。HUVECs应达到约80%汇合度，形态应与生产商提供的标准一致。
8. 将标记的细菌以5,000 × g离心10分钟，以去除残留的BCECF-AM染料，然后重悬于2 mL厌氧VEGF培养基中。
9. 以感染复数（MOI）100:1（细菌:宿主细胞）的比例感染宿主细胞。
10. 在厌氧舱内37 °C孵育30分钟。
11. 感染后用PBS洗涤细胞三次，并用新配制的4.0%多聚甲醛固定10分钟。
    注意：细胞固定后，后续实验可在厌氧舱外进行。
12. 用PBS洗涤盖玻片三次。
13. 加入1 mL 0.2% Triton X-100，作用10分钟。
14. 用PBS洗涤盖玻片三次。
15. 向盖玻片上加入50 µL TRITC鬼笔环肽（50 µg/mL），避光孵育45分钟。
16. 洗涤盖玻片三次，从12孔板中取出，置于载玻片上，使用含DAPI的软封片剂封片，并用指甲油密封边缘。
    注意：载玻片可在避光条件下保存数月。应避免光照，以防荧光淬灭。
17. 使用共聚焦显微镜观察样品。
    1. 此处使用基于AxioObserver（倒置）显微镜平台的34通道光谱系统（包含32通道阵列探测器、两个侧置PMT探测器及透射光探测器），配备电动XY载物台。系统配备五种激光器：蓝色二极管（405 nm）、多线氩离子（458、488、514 nm）、绿色二极管（561 nm）、红色HeNe（633 nm）以及440 nm脉冲激光器。荧光寿命成像系统（FRET-FLIM）配备两个杂化GaAsP探测器。
    2. 使用双通滤光片在单通道中同时检测DAPI和TRITC的荧光信号，激发波长分别为340–380 nm和540–560 nm，发射波长分别为435–485 nm和570–590 nm。BCECF-AM的荧光检测使用激发波长440–500 nm、发射波长510–590 nm的滤光片。
       注意：对每种研究的细菌菌株均应设置BCECF-AM对照实验，以确保活菌标记正确。首先验证死菌为DAPI阳性而BCECF阴性；其次确认活菌能够将BCECF-AM代谢为荧光素BCECF。可能需要测试不同浓度的细菌或BCECF-AM染料，以获得最佳标记效果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙烯厌氧培养箱-型号B	Coy Laboratory Products		Model 2000 培养箱
含5%羊血的TSA II胰蛋白酶大豆琼脂	BBL	221261
人脐静脉内皮细胞（10名供者混合样本）	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF完全培养基试剂盒	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC鬼笔环肽	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm圆形盖玻片	Electron Microscopy Sciences	72222-01
含DAPI的VectaShield封片剂	Vector Laboratories	H-1200