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1. 细菌内化到宿主细胞中（荧光显微镜）
>注:P. gingivalis 用 2'，7'-Bis-（2-羧乙基）-5-（和-6）-羧基荧光素，乙酰氧基甲酯 （BCECF-AM） 标记。BCECF-AM 是一种非荧光膜渗透性染料;它通过细胞内酯酶的作用转化为荧光素 BCECF 可以指示细胞活力。P. gingivalis 用 BCECF-AM 染料标记，然后用于感染真核细胞。感染后，固定细胞并用 DAPI 和 TRITC-鬼笔环肽标记。用于染色真核细胞核的 DAPI 染色剂也将标记细菌细胞核，这为识别不能代谢裂解 BCECF-AM 的无活力细菌提供了一种对策。宿主细胞用 TRITC-鬼笔环肽（一种红色肌动蛋白染料）突出显示。
- 高压灭菌器盖玻片。在以 5 x 104 个细胞/孔接种内皮细胞之前，无菌地将盖玻片添加到 12 孔板中。（实验前一天准备）
- 如上所述，在 12 孔板中的 18 mm（#1.5 厚度）圆形盖玻片上制备内皮细胞。
- 准备生长至对数中期的厌氧菌 （OD660 = 0.5-0.7）。
- 通过以 5,000 x g 离心并将沉淀以 5-7 x 108 个细胞/ml 的浓度悬浮在 PBS 中，用厌氧 PBS 洗涤细菌 2 次。
- 将 20 μl 0.2 mM BCECF-AM 添加到 2 ml 细菌悬液（5-7 x 108 个细胞/ml）中，使 BCECF-AM 的终浓度为 2 μM。
- 在 37 °C 下避光孵育 30 分钟。
- 将接种在 18 mm（#1.5 厚度）圆形盖玻片上的内皮细胞的板从组织培养箱转移到厌氧室中。用 PBS 洗涤并与厌氧 VEGF 培养基交换><。
注意:验证 HUVEC 在光学显微镜下是否健康。HUVECS 应达到 ~80% 汇合度，形态应与制造商相当。
- 以 5,000 x g 离心标记的细菌 10 分钟以去除残留的 BCECF-AM 染料。悬浮在 2 ml 厌氧 VEGF 培养基中。
- 用 MOI 为 100:1 的标记细菌感染宿主细胞（细菌:宿主）。
- 在 37 °C 的厌氧室中孵育 30 分钟。
- 感染后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，并在新鲜制备的 4.0% 多聚甲醛中固定 10 分钟
注意:固定细胞后，可以在厌氧室外进行实验。
- 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次。
- 加入 1 ml 0.2% Triton X-100 10 10 分钟。
- 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次。
- 向盖玻片中加入 50 μl TRITC 鬼笔环肽 （50 μg/ml） 45 分钟。
- 洗涤盖玻片 3 次，从 12 孔板中取出，并放在载玻片上，用含有 DAPI 的软固型封固剂。用指甲油密封侧面。
注意: 玻片可以在黑暗中存放几个月。避免光照，以防止光漂白。
- 使用共聚焦显微镜查看载玻片。
- 在这里，使用一个 34 通道光谱系统（32 通道阵列探测器和两侧 PMT 探测器，加上一个透射光探测器），该系统配置在带有电动 XY 载物台的 AxioObserver（倒置）支架周围。该系统有五个激光器:蓝色二极管 （405 nm）、多线氩 （458、488、514 nm）、绿色二极管 （561 nm）、红色氦氖 （633 nm） 和 440 nm 脉冲激光器。为荧光寿命成像系统配备 2 个混合 GaAsP 检测器（用于 FRET-FLIM）。
- 使用激发波长分别为 340-380 nm 和 540-560 nm 的双波段滤光片以及 435-485 nm 和 570-590 nm 的发射滤光片，在一个通道中检测来自 DAPI 和 TRITC 的荧光。使用激发波长为 440-500 nm 的滤光片和 510-590 nm 发射滤光片检测来自 BCECF-AM ><的荧光。
注意:应对正在研究的每种细菌菌株进行 BCECF-AM 的对照，以确保正确标记活细菌。首先验证无活力细菌是 DAPI 阳性和 BCECF 阴性。其次，确保活细菌能够将 BCECF-AM 代谢成荧光素 BCECF。可能需要测试不同浓度的细菌或 BCECF-AM 染料以实现最佳标记。