针对细菌病原体的调理吞噬杀伤活性评估

摘要

来源：Paschall, A. V. 等，评估针对细菌病原体免疫应答的调理吞噬杀伤实验。J. Vis. Exp. (2019)

视频展示了 体外 使用人中性粒细胞共培养的调理吞噬杀伤试验 肺炎链球菌抗体和补体蛋白促进细菌的调理作用，使中性粒细胞能够识别并杀灭细菌，表明中性粒细胞具有成功的调理吞噬活性。

方案

1. HL-60 细胞的培养、分化与验证

1. 准备 HL-60 细胞培养基，成分为 500 mL 含 L-谷氨酰胺的 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 培养基和 50 mL 热灭活胎牛血清。不要添加抗生素，以免影响 HL-60 细胞的分化。
2. 用于HL-60细胞的传代/维持，培养5 × 10⁵个细胞/mL至2 × 10⁶个细胞/mL，置于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中，在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育⁶ 75 cm² 培养瓶中加入 10 mL HL-60 细胞培养基的细胞² 通气培养瓶，37 °C 和 5% 二氧化碳（CO₂）₂每3−4天传代一次细胞，以维持最佳细胞浓度。
   注意： 细胞浓度不应超过 5 x 10⁶/mL
3. 通过分装约 1 x 10⁶ 个 HL-60 细胞生成工作细胞株⁶ 细胞/mL，加入含10%二甲基亚砜（DMSO）的HL60培养基，分装至1 mL冻存管中。
   注意： 工作液可保存在 -80 °C；主储备液应保存在 -120 °C。
4. 通过将 HL-60 细胞以 1.5 × 10⁵ 细胞/mL 的密度接种并在含 1.25% DMSO 的培养基中培养 4 天，诱导其向中性粒细胞方向分化。⁷ 37 °C、5% CO₂条件下，将细胞置于含0.6% N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的15 mL HL-60细胞培养基中培养₂ 无菌滤器封口的75 cm²培养瓶中² 在进行调理吞噬杀伤活性实验前3天使用培养瓶 (OPKA
5. 通过流式细胞术检测细胞活力和细胞表面标志物，验证HL-60细胞是否成功分化并适用于OPKA实验。分化完成后，收集HL-60细胞，取约1 x 10⁶细胞进行染色⁴ 使用荧光标记的抗体/染料对CD71、CD35、annexin V和碘化丙啶进行染色的细胞。
   注意： 分化细胞的存活率应 ≥65%，CD35 阳性率应 ≥55%⁺，以及≤20% CD71⁺ 通过既定的验证方案确定（图1).

2. OPKA 缓冲液和试剂的准备

1. 通过将42.5 mL无菌含Ca²⁺/Mg²⁺的1×磷酸盐缓冲液（PBS）、5 mL热灭活的胎牛血清和2.5 mL 0.1%无菌明胶混合，配制50 mL无菌调理缓冲液B（OBB）。4 °C保存。
2. 获取幼兔补体，并于-80 °C保存。
3. 获取或制备细菌培养平板（即15 × 100 mm² 5%绵羊血琼脂平板）。

3. 细菌菌种样品的制备

1. 获取待测的细菌菌株菌种。
   注意： 对于本方案，血清型 3 肺炎链球菌 （WU2，由Moon Nahm博士惠赠）被使用。
2. 将细菌菌株在适当的肉汤培养基中（例如，对于该WU2菌株，使用Todd-Hewitt肉汤加0.5%酵母提取物）于37 °C培养约2−4小时。
   注意： 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀培养物的光密度值（OD）应在 0.6 至 0.8 之间。
3. 通过离心沉淀细菌，离心条件为 6,000 x g 孵育2分钟，然后将细胞重悬于10−30 mL含15%甘油的适当培养基中。将菌液按500 µL每份分装至无菌的1.5 mL离心管中，于-80 °C保存。
4. 在37 °C水浴中解冻一管细菌菌种。在无菌条件下，将细菌细胞离心沉淀并重悬于500 µL OBB中。
5. 在OBB中制备细菌原液的不同稀释度（例如，未稀释液10 µL、1:10稀释液10 µL、1:100稀释液10 µL等）。按照下述方法，使用未经处理的细菌原液的不同稀释度进行OPKA实验（包括第4–6节及HL-60/补体共培养）。将培养板在30 °C条件下过夜培养（无需CO₂）₂).
   注意： 30 °C 的温度是针对 WU2 防止过度生长的特定条件；其他菌株/血清型可能在 37 °C 下生长最佳。
6. 对未经处理的细菌原液与HL-60细胞及补体共培养后的各稀释度菌落进行计数。确定哪个稀释度的细菌可产生最佳可计数菌落数量（对于与HL-60细胞及补体共培养的未经处理细菌，理想范围约为80−120个菌落形成单位（CFUs））。 注意 此稀释液可用于今后涉及该细菌菌种的OPKA实验。

4. 细菌处理与培养

1. 解冻在步骤3.3中制备的一管细菌储备液。离心收集细菌（6,000 × g，2分钟），并根据步骤3.6确定的最佳稀释比例，将菌体沉淀重悬于OBB中。
2. 在圆底96孔细胞培养板中，每孔加入10 µL重悬后的细菌稀释液。
3. 在每个实验孔中，以复孔形式加入20 µL相应的抗体或药物处理液。
   注意：在本实验方案中，使用小鼠来源的血清型特异性抗体作为处理X，使用已知可降解3型多糖荚膜的糖苷水解酶作为处理Y（图2）。对照孔则根据处理孔所用缓冲液，使用1× PBS或OBB。
4. 将样品板在室温下以约90 rpm振荡1小时。根据所测试处理物的最佳温度或振荡条件，可对这些条件进行调整。

5. HL-60 细菌共培养

1. 通过收集经DMF处理三天前的HL-60分化细胞（参见步骤1.4），将其转移至15 mL圆锥形离心管中以制备HL-60细胞。离心沉淀细胞（500 x g，3 分钟），弃去上清液，并用至少 10 mL 的 1× PBS 洗涤。
2. 离心收集洗涤后的细胞（500 × g） g，3 分钟），弃去上清液，将细胞重悬于 OBB 中（起始使用 1 mL OBB，并调整至终浓度为 1 × 10⁷/mL（细胞计数后）
3. 加入幼兔补体（无菌、未稀释的幼兔血清，3−4 周龄），终体积比为 1:5。
   注意： HL-60-补体混合物的最终浓度应为 1 x 10⁷/mL。若需检测补体依赖性，可使用第二种溶液，其中包含活性HL-60细胞和热灭活补体（补体可通过在水浴中37°C孵育30分钟进行灭活）。 >55 °C 至少 30 分钟。
4. 细菌培养1小时完成后（步骤4.4），将每个样品（即每个30 µL样品取10 µL）均分至两个新的孔中，形成两个重复孔：一组用于与HL-60补体共培养，另一组仅含细菌。为避免移液误差，每孔使用20 µL原始30 µL共培养液。向实验组孔（标记为+HL-60）中加入50 µL HL-60补体混合液（来自步骤5.3）；向仅含细菌的孔（标记为-HL-60）中加入50 µL OBB培养基。
   注意： 在此示例中，使用约800个细菌CFU与5 x 10⁵/50 µL HL-60 细胞。如果最终菌落数表明感染复数过高或过低，应调整初始细菌稀释度，而非 HL-60 细胞数量。
5. 在37 °C下振荡96孔板1小时（无CO₂）₂).

6. 样品涂布与过夜培养

1. 用 OBB 将每个孔稀释至 1:5，使每个样品的体积至少为 50 µL。
2. 用移液器将每种样品各 50 µL 直接加至细菌培养板的指定区域，确保样品之间有足够的间距。对于 15 × 100 mm² 的圆形琼脂平板，每块平板上移液约 4 个样品。
3. 盖上皿盖，于室温下静置干燥约 15 分钟。
4. 将平板倒置，在 30 °C 下过夜培养（无需 CO₂）。或者，将平板置于厌氧罐中培养，以检测无氧条件是否影响细菌生长，或用于形态学对照。
5. 过夜培养后，计数每个指定样品区域内的菌落。通过将每组活细胞数量与相应对照组和/或未与 HL-60 细胞共培养的样品进行比较，分析数据（代表 100% 细胞存活率，0% 细胞杀伤率）。

结果

图1：通过流式细胞术验证HL-60细胞的分化。 收集已分化的HL-60细胞，洗涤后重悬于PBS中，细胞浓度为1 × 10⁵ 个细胞/mL。随后将细胞分装至96孔板中的12个孔（每孔100 µL）。接着使用荧光标记的抗CD35抗体、抗CD71抗体、Annexin V以及碘化丙啶对细胞进行染色。未染色细胞或使用荧光标记同型对照抗体染色的细胞作为对照。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Annexin V（APC 标记）	BioLegend	640919
抗 CD35 抗体，人源（PE 标记）	BioLegend	333405
抗 CD71 抗体，人源（PE 标记）	BioLegend	334105
拟使用的细菌菌株（例如，肺炎链球菌 WU2）	细菌性呼吸道参考实验室（Moon Nahm 博士）
血琼脂平板	Hardy Diagnostic	A10
胎牛克隆血清	HyClone	SH30080.03
甘油	Sigma	G9012-1L
HL-60 细胞	ATCC	CCL-240
IgG 同型对照（PE 标记）	BioLegend	400907
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）	Fisher Chemical	UN2265
碘化丙啶	Sigma	P4864
含 L-谷氨酰胺的 RPMI 培养基	Corning	10-040-CV