评估内化 牙龈卟啉单胞菌 在宿主内皮细胞中

摘要

来源：Wunsch, C. M., 等 牙龈卟啉单胞菌 作为评估厌氧菌与宿主细胞相互作用的模式生物。 视频实验杂志. (2015)

在本视频中，我们演示了一种用于评估存活率的实验方法 牙龈卟啉单胞菌 在人内皮细胞内的存活与生长情况 牙龈卟啉单胞菌 通过血琼脂平板上的菌落数量进行评估。

方案

1. 胞内细菌的存活情况。

1. 培养牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）厌氧细菌，直至其达到对数生长期中期（OD₆₆₀ 为 0.5–0.7）。
2. 在 5,000 × g 条件下离心 10 分钟。
3. 将离心后的 P. gingivalis 菌体重新置于厌氧舱内，弃去上清液。用 PBS 洗涤一次后再次离心，随后重悬于 VEGF 培养基中。将所有待测菌株均配制成 OD₆₆₀ 为 0.7 的菌悬液，该浓度对应于对数生长期中期（约 7 × 10⁸ 个细胞/ml）。此时细菌已准备好用于感染实验。
4. 将含有 HUVECs 的 6 孔板从组织培养孵箱转移至厌氧舱内，吸去培养基，并用厌氧 PBS 洗涤三次。每孔加入 2 ml 厌氧 VEGF 培养基，将 6 孔板置于 37 °C 厌氧孵箱中孵育 20 分钟，以使温度平衡，为感染做准备。
5. 以感染复数（MOI，细菌:宿主细胞）为 100:1 的比例进行感染。
   注意： 感染前通过台盼蓝排斥法测定单孔 HUVECs 的细胞数量。细菌数量通过光密度测定（例如，OD 0.5 = 5 × 10⁸ 个细胞/ml）。根据 HUVECs 的浓度调整细菌浓度，以达到正确的 MOI。
6. 将感染后的 HUVECs 6 孔板放入厌氧孵箱中，使细菌与宿主细胞相互作用 30 分钟。
7. 在厌氧舱内配制含 1.0%（w/v）皂苷的 BHI 溶液，并通过 0.2 µm 滤器过滤除菌。
8. 从孵箱中取出 6 孔板，用厌氧 PBS 洗涤三次，每孔加入 2 ml 含抗生素的 VEGF 培养基（含 300 µg/ml 庆大霉素和 400 µg/ml 甲硝唑）。
9. 孵育 1 小时。务必预先验证所用抗生素对目标菌株具有完全杀灭效果，并确认其不会穿透宿主细胞。
10. 吸去培养基，每孔加入 2 ml 过滤除菌的 1.0% 皂苷溶液，孵育 15 分钟以裂解宿主细胞。
11. 用细胞刮刀刮取每孔底部细胞残余物，收集各孔中的细胞混合液，并用 BHI 培养基进行 1:1 稀释。
12. 对样品进行系列稀释（1:100，1:1,000）。
13. 取 200 µl 适当稀释度的样品接种于血琼脂平板上，用封口膜包裹平板后置于厌氧孵箱中。
14. 在 37 °C 厌氧条件下孵育七天后取出平板，计数菌落形成单位（CFU）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙烯厌氧培养箱-型号B	Coy Laboratory Products		Model 2000 培养箱
含5%羊血的TSA II胰蛋白酶大豆琼脂	BBL	221261
人脐静脉内皮细胞（10名供体混合样本）	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF完全培养基试剂盒	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
皂苷	Riedel-de Haen	16109
硫酸庆大霉素盐	Sigma-Aldrich	G-1264
甲硝唑	Sigma-Aldrich	M-3761