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一种评估肿瘤特异性抗体在体内定位的技术

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源：Shivange, G.，等。靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤和组织中的分布分析。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种在小鼠肿瘤异种移植模型中研究肿瘤特异性抗体体内定位的技术。将癌细胞皮下注射至小鼠体内以形成肿瘤后，注射可结合肿瘤特异性受体的荧光标记抗体，从而通过成像技术实现对抗体体内定位的评估。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 抗体的表达与纯化

  1. 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的培养
    1. 在含商业化1倍谷氨酰胺补充剂的FreeStyle CHO培养基中，于37 ˚C、130 rpm振荡条件下，使用带挡板的Erlenmeyer烧瓶（玻璃或一次性）并在5% CO2环境中培养CHO细胞。
      注意：强烈建议使用带挡板且带通气盖的烧瓶，以增强搅拌并改善振荡过程中的气体交换。使用普通烧瓶（无挡板）时，由于悬浮培养的搅拌受限，抗体产量显著降低。
    2. 维持细胞密度在1–5 × 106 个细胞/mL之间，细胞活力需保持在>95%。若细胞密度超过5 × 106 个细胞/mL，应进行传代。切勿使CHO细胞密度低于0.2 × 106 个细胞/mL。
  2. CHO细胞的转染
    1. 在200 mL培养基（2 × 106 个细胞/mL）中，使用带挡板的Erlenmeyer烧瓶培养CHO细胞。
      注意：在带挡板烧瓶中培养的悬浮细胞，其蛋白产量始终高于在无挡板烧瓶中培养的细胞。
    2. 在15 mL离心管中，加入5 mL CHO FreeStyle培养基，再加入50 μg VH克隆DNA和75 μg VL克隆DNA，涡旋混匀。
    3. 将DNA混合物在室温下孵育5分钟。
      注意：延长孵育时间会降低蛋白产量。
    4. 向DNA溶液中加入750 μL 1 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）储备液，剧烈涡旋30秒，室温再孵育5分钟。
      注意：PEI必须新鲜配制。多次冻融循环会显著降低总体产量。
    5. 在手动摇动烧瓶的同时，将全部DNA-PEI混合物加入细胞中。立即将含细胞的带挡板Erlenmeyer烧瓶置于37 ˚C、130 rpm条件下振荡培养。
  3. 表达
    注意：该抗体在其N端含有工程化的分泌信号肽，有助于抗体分泌至培养基中。
    1. 在第1天，将转染后的细胞在37 ˚C、130 rpm振荡条件下继续培养。
    2. 第2天，加入2 mL 100倍防结团试剂和2 mL 100倍抗菌-抗真菌溶液，并将烧瓶转移至较低温度（32–34 ˚C），继续以130 rpm振荡培养。
    3. 每隔五天，加入10 mL Tryptone N1培养添加剂和2 mL 100倍谷氨酰胺补充剂。
    4. 每隔三天使用血细胞计数板对台盼蓝染色后的细胞样品进行细胞计数，确保细胞活力维持在80%以上。
    5. 第10或第11天，收集培养基用于抗体纯化。在4 ˚C条件下以3000 x g离心40–60分钟，随后使用0.22 µm瓶式滤器过滤上清液。
  4. 纯化
    注意：抗体纯化使用市售的Protein-A柱（见材料表），并配合蠕动泵进行。
    1. 用两倍柱体积的结合缓冲液（pH 7.4的20 mM磷酸钠）平衡层析柱。
    2. 以1 mL/min的流速将含抗体的滤过培养基（来自步骤1.3.5）通过层析柱。
    3. 用两倍柱体积的结合缓冲液洗涤层析柱。
    4. 使用5 mL洗脱缓冲液（pH 3.4的30 mM醋酸钠）以500 μL为一份进行抗体洗脱。
    5. 每份洗脱液中加入10 μL中和缓冲液（pH 9的3 M醋酸钠）以中和抗体的pH值。
      注意：第3至第6份洗脱液中含有大部分抗体。建议保留所有洗脱组分，以防抗体洗脱晚于预期。
    6. 使用分光光度计选择免疫球蛋白G（IgG）的默认程序测定纯化抗体的浓度。通过考虑分子量和吸光系数，最终获得以mg/mL为单位的抗体浓度。

2. 荧光标记

注意： 抗体使用含有 NHS 酯反应基团的红外染料进行标记，该基团可与蛋白质结合并形成稳定的共轭物。此反应对 pH 敏感，在 pH 8.5 时效果最佳。用该染料标记的荧光共轭物在 774 nm 处有最大吸收峰，在 789 nm 处有最大发射峰。pH 8.5 是实现有效共轭的关键条件。

  1. 使用透析盒（0.1–0.5 mL）将0.5 mL抗体在1 L偶联缓冲液（pH 8.5的50 mM磷酸盐缓冲液）中进行透析。4小时后，将透析盒转移至新鲜缓冲液中，继续透析过夜。
  2. 在500 μL反应体系中，每1 mg抗体加入0.03 mg IRDye 800CW，建立偶联反应。
    注意：IRDye 800CW以10 mg/mL浓度溶于DMSO中。
  3. 在20 °C下进行2小时标记反应。
    注意：反应时间超过2小时不会提高标记效率。
  4. 通过在1× PBS中进行充分透析，纯化标记后的偶联物。
  5. 通过测定染料在780 nm处的吸光度和蛋白质在280 nm处的吸光度，估算标记程度。染料在280 nm处的吸光度贡献为3%。
  6. 使用以下公式计算染料/蛋白比（D/P比）：
    光谱分析中染料与蛋白比的计算公式。
    其中0.03为染料在280 nm处吸光度的校正因子（相当于其在780 nm处吸光度的3.0%），εDye 和 εProtein 分别为染料和蛋白（抗体）的摩尔消光系数。
    注意：在PBS:甲醇（1:1）混合液中，εDye为270,000 M-1 cm-1，εProtein为203,000 M-1 cm-1（针对典型IgG）。非IgG类蛋白的摩尔消光系数可能显著不同。为准确测定D/P比，必须使用目标蛋白对应的正确消光系数。
  7. 使用以下公式计算最终蛋白浓度：
    蛋白浓度计算公式；用于蛋白定量的光谱分析。
    注意：在开展体内研究之前，务必通过ELISA（酶联免疫吸附测定）或流式细胞术验证标记与未标记抗体的抗原结合活性。

3. 小鼠异种移植研究

  1. 注射用肿瘤细胞的制备
    1. 在 RPMI-1640 培养基中培养 OVCAR-3 细胞，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1× 青霉素-链霉素。
    2. 注射前一天，将细胞传代至新的 100 mm 培养皿中，每皿加入 10 mL 完全培养基，接种细胞数量为每皿 0.5–1 × 106 个细胞。
    3. 将培养物置于 37 °C、95% 湿度和 5% CO2 条件下孵育 20–24 小时。
    4. 在注射当天，从培养皿中移除生长培养基。用不含 Ca2+/Mg2+ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）彻底冲洗细胞层，以去除死细胞、细胞碎片以及可能干扰胰蛋白酶作用的血清残留。
    5. 向每皿中加入 1.0–1.5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液进行消化，并通过倾斜培养皿使溶液均匀分布，随后在 37 °C 下孵育 5–10 分钟。
      注意：需在倒置显微镜下观察细胞，以判断实际消化状态。消化不足会导致较少细胞从培养皿表面脱落，而过度消化则会引起细胞应激。因此，适当的消化至关重要。
    6. 每皿加入 1.0–1.5 mL 完全生长培养基以终止胰蛋白酶作用，随后轻轻吹打重悬细胞。
      注意：轻柔吹打对维持细胞活性非常重要。
    7. 将细胞悬液收集至 15 mL 圆底离心管中，在室温下以 250 x g 离心 5 分钟。
    8. 弃去上清液后收集细胞沉淀，并用 1× DPBS 重悬沉淀以洗涤细胞。
    9. 将细胞悬液以较低速度 250 x g 离心 5 分钟。
    10. 加入 500 µL DPBS，通过轻柔吹打重悬细胞，获得单细胞悬液。
    11. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
      注意：为提高准确性，建议重复计数三次并取平均值。
    12. 调整体积，使最终细胞密度达到 1 × 108 个细胞/mL。
  2. 皮下注射细胞以建立小鼠异种移植模型
    注意：所有操作应在 BSL2 生物安全柜中进行。本研究使用了裸鼠 Foxn1nu/Foxn1+。
    1. 取 50 µL 细胞悬液加入 1.5 mL 离心管中，与 50 µL 基底膜基质培养基混合。
      注意：基底膜基质培养基在室温下易形成凝胶状，因此需将细胞与基质混合物小心置于冰上。建议将离心管、枪头和注射器先冷藏，使用前再转移至冰上。
    2. 轻轻混匀混合物以避免细胞聚集。然后将含有 5 × 106 个细胞的 100 µL 细胞悬液-基质混合物吸入 1 cc 注射器中。
    3. 轻轻提起动物皮肤，使其与下方肌肉层分离，使用 26 G 针头将细胞悬液（100 µL，含 5 × 106 个细胞）缓慢注入皮下。拔针前等待数秒，使基底膜基质能在皮下与细胞共同形成半固态凝胶结构，防止混合物从注射部位溢出。
      注意：注射前需检测细胞是否污染，以免对免疫缺陷小鼠造成伤害。注射时避免针头刺入过深，否则可能导致肿瘤形成位置过深。
    4. 将动物置于无菌笼中，并观察约 20 分钟。
    5. 观察小鼠 2–3 周，待肿瘤生长至约 500 mm3 大小。

4. 使用活体成像系统进行抗体定位

注意：本实验中使用的活体成像设备（参见材料表）采用一组高效率滤光片和光谱分离算法，可对活体生物体内细胞和基因活动进行无创、实时的可视化观察与追踪。该系统具备荧光和生物发光检测功能。

  1. 通过尾静脉注射 25 μg 荧光标记抗体。
    1. 使用 2% 异氟烷麻醉荷瘤小鼠，并检查其足底反射是否消失。
    2. 待小鼠停止活动后，用温水扩张尾部侧静脉。
    3. 使用带 26 G 针头的 1 cc 胰岛素注射器，注射 25 μg（溶于 100 μL）标记抗体。
    4. 作为阴性对照，同样标记并注射不靶向癌细胞的非特异性 IgG1 同型抗体。
  2. 在抗体注射后 8、24、48 小时等时间点进行活体实时成像。
    1. 在配套软件中，点击控制面板中的 Initialize，并确认载物台温度为 37 °C。
    2. 打开氧气供应、麻醉系统中的所有泵以及麻醉室的异氟烷气体供应，将异氟烷蒸发器阀门设定为 2%。
    3. 将小鼠转移至麻醉室，等待其完全麻醉，并涂抹眼用润滑软膏以防止眼睛干燥。
    4. 进入 Control panel，通过 Imaging Wizard 选项设置荧光成像，选择激发波长为 773 nm，发射波长为 792 nm。
      NOTE: 默认的自动曝光设置即可获得良好的荧光图像。但可根据需要调整自动曝光参数。
    5. 将麻醉后的小鼠转移至成像室，并使用鼻罩将其固定在成像区域。成像载物台可同时容纳最多 5 只小鼠。
      NOTE: 分析时应将对照组小鼠与实验组小鼠一同成像，以确保曝光和其他设置条件一致。
    6. 一切准备就绪后，在控制面板上选择 Acquire 选项以开始图像采集。
    7. 在 Autoexposure settings 下，系统将在一分钟内生成图像。所生成的图像为荧光信号叠加在光学照片上的融合图像，光学荧光强度以计数单位、光子数或效率单位显示。
    8. 图像采集完成后，将小鼠从成像室转移回笼中，并观察其恢复情况 1 至 2 分钟。
  3. 利用软件提供的工具和功能进一步优化图像，用于图像分析。图像分析工具位于菜单栏和工具面板中。
    1. 在 Image Adjust 下，调节亮度、对比度或不透明度，并选择颜色标尺。
    2. 使用 ROI Tools 在光学图像中划定感兴趣区域（ROI），并测量该区域内的信号强度。如有需要，可将定量信号数据导出至电子表格软件并进行绘图分析。
    3. 对于后续研究，可并排分析不同组织（如肝脏、肺、心脏、肾脏、脾脏、脑等）的小鼠解剖样本，以详细评估荧光标记抗体的非特异性分布情况。
      NOTE: 可通过使用抗原（本例中为 FOLR1）进行 96 孔 ELISA 实验，进一步验证组织特异性数据。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FreeStyle CHO 培养基Gibco Life TechnologiesCat # 12651-014
Anti-Anti (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 15240-062
防结块剂Gibco Life TechnologiesCat # 01-0057DG
BD 胰岛素注射器BD BioSciencesCat #329420
Caliper IVIS SpectrumPerkinElmerCat #124262
CHO CD EfficientFeed BGibco Life TechnologiesCat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）CorningCat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640CorningCat # 10-040-CV
Cy5 标记的抗人 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearchCat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 35050-061
HiPure 质粒大提试剂盒InvitrogenCat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe 柱GE HealthcareCat # 11-0034-93
InfusionTakara BioScienceSTO344
IRDye 800CW NHS 酯LI-CORCat # 929-70020
异氟烷，USPCovetrusCat # 11695-6777-2
润滑性眼膏Refresh Lacri-LubeCat #4089
MatrigelCorningCat # 354234
PEI 转染试剂Thermo FisherCat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer 透析夹Thermo ScientificCat # 66333
Steritop 真空滤器Millipore ExpressCat #S2GPT02RE
胰蛋白酶-EDTAGibco Life TechnologiesCat # 15400-054
实验模型：细胞系
人：OVCAR-3美国模式培养物集存库ATCC HTB-161
人：CHO-K 细胞本实验室稳定转染获得ATCC CCL-61
小鼠：4T1由 UVA 的 Chip Landen 博士惠赠
小鼠：MC38由 UMBC 的 Suzanne Ostrand-Rosenberg 博士惠赠通过 STR 分型验证
小鼠：MC38 hFOLR1本实验室构建（本文）
实验模型：动物
小鼠：裸鼠 Foxn1nu/Foxn1+Envigo多次订购
小鼠：NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson Laboratory多次订购

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荧光抗体标记小鼠异种移植模型叶酸受体α-1抗体偶联活体荧光成像肿瘤异种移植形成抗体纯化荧光成像系统设置
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