结核分枝杆菌感染巨噬细胞亚群的流式细胞术染色

摘要

来源：Mily, A., 等 人源单核细胞来源M1与M2型极化及流式细胞术分析 结核分枝杆菌 感染。 视频实验杂志 (2020)

本视频展示了一种利用多色荧光抗体组合的流式细胞术设门策略，用于分析细胞活力及特定的荧光标记抗人抗体标志物。该方法能够准确测定结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染细胞群体的百分比。

方案

1. 结核分枝杆菌感染的单核细胞来源细胞的流式细胞术染色

注意：以下步骤必须在生物安全三级（BSL-3）设施中进行。流式细胞术染色可在96孔板中进行，而非离心管中。

1. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下，通过向 6 孔板的每孔中加入 1 mL FACS 缓冲液孵育至少 30 分钟，使结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染的细胞（以及未感染的对照组细胞）从孔壁上脱落。
2. 轻轻吹打数次以确保细胞完全脱落。如有可能，通过显微镜观察确认细胞是否已完全脱落。将每孔中的细胞悬液转移至带螺旋盖的微量离心管中，在 200 x g 下离心 5 分钟。小心用移液器吸弃上清液。
3. 用 FACS 缓冲液将每管中的细胞沉淀洗涤两次，每次在 200 x g 下离心 5 分钟。
4. 将细胞（约 0.5 × 10⁶ 至 1 × 10⁶ 个细胞/管）与约 50 µL 荧光染料标记的抗人抗体混合液（包括 TLR2 (AF647)、CD206 (APC-Cy7)、CD163 (BV605)、CD80 (BV650)、CCR7 (BV711)、CD86 (BV786)、CD200R (PE)、CD64 (PE-Dazzle 594)、HLA-DR (PE-Cy5)（表 1））以及活死染料 Zombie-UV 混合，在 4 °C（冰箱内）避光孵育 30 分钟。
5. 用 400 µL FACS 缓冲液将染色后的细胞洗涤两次，每次在 200 x g 下离心 5 分钟。
6. 用 200 µL 新鲜配制的固定缓冲液在室温避光条件下固定染色细胞 30 分钟，以确保分枝杆菌完全失活。
7. 用 400 µL FACS 缓冲液将细胞洗涤两次，每次在 200 x g 下离心 5 分钟，以去除多余的固定液。
8. 将固定后的细胞重悬于 400 µL FACS 缓冲液中，并将样品转移至新的 1 mL 微量离心管中，随后在进行 BSL-2 级流式细胞术检测前带出 BSL-3 实验室。样品采集前将染色细胞保存在 +4 ˚C 条件下。
   注意：将样品管带出 BSL-3 实验室前需喷洒 70% 乙醇进行表面消毒。甲醛具有毒性（致癌性），必须在 II 级生物安全柜中操作。甲醛废液应作为单独的化学废弃物进行处理。

2. 结核分枝杆菌感染的单核细胞来源细胞的流式细胞术数据采集与分析

注意：步骤 2.1–2.2 应在上述流式细胞术染色之前预先完成。为避免细胞固定后出现细胞聚集以及串联染料解离等问题，结核分枝杆菌（Mtb）感染和未感染细胞的样本采集均应在一抗染色后 4–10 小时内进行。

1. 在进行上述流式细胞术染色之前，使用补偿微珠（包括阳性和阴性）对染色方案中所列的每种荧光素偶联抗体（表1）进行荧光信号补偿。
2. 对人巨噬细胞染色所用抗体进行稀释度滴定，以获得每种荧光素的最佳信号。
3. 使用未染色细胞确定背景荧光水平，从而设定阴性细胞群的设门阈值，以便观察染色细胞（巨噬细胞具有较强的自发荧光）。
4. 使用推荐的数据采集软件，在流式细胞仪上每样本至少采集 50,000 个细胞。
5. 将以流式细胞术标准（FCS）3.1 格式导出流式细胞仪的采集文件。
6. 在流式细胞术分析软件中分析 FCS 文件。
7. 根据前向散射光和侧向散射光（FSC 和 SSC）特征设门圈选巨噬细胞，并使用 Zombie-UV 活死细胞染料通过活死细胞设门排除死细胞。
8. 在 FITC 通道中观察 H37Rv-GFP 感染的巨噬细胞。
9. 确定所有标记物（表1）阳性染色细胞的频率及几何平均荧光强度（MFI）。

表1：流式细胞术所用抗体列表。

激光	滤光片	荧光染料	表型	功能	克隆	货号	公司
639	670/30	AF647	TLR2	病原体识别受体	TL2.1	309714	BioLegend
639	780/60	APC-Cy7	CD206	甘露糖受体	15-2	321120	BioLegend
405	610/20	BV605	CD163	清道夫受体	GHI/61	333616	BioLegend
405	670/30	BV650	CD80	共刺激分子	2D10	305227	BioLegend
405	710/50	BV711	CCR7	趋化因子受体	G043H7	353228	BioLegend
405	780/60	BV785	CD86	共刺激分子	IT2.2	305442	BioLegend
488	530/30	GFP	Mtb	胞内细菌
561	586/15	PE	CD200R	抑制性受体	OX-108	329306	BioLegend
561	620/14	PE/DAZZLE 594	CD64	IgG 的 Fc gamma 受体-I	10.1	305032	BioLegend
561	661/20	PE-Cy5 (PC5)	HLA-DR	MHC II 类分子	L243	307608	BioLegend
355	450/50	BUV395	活力染料	活/死细胞标记物	Zombie UV	423108	Invitrogen

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甲醛	Sigma-Aldrich	F8775
山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 594二抗	Invitrogen	R37121	CD64二抗
山羊抗兔IgG Alexa Fluor 594二抗		A-11037	CD163二抗
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F7524
EDTA（0.5 M）	Karolinska University hospital, Huddinge	N/A
BD Comp bead plus	BD	560497