一种体外检测细胞因子诱导杀伤细胞细胞毒性的实验方法

摘要

来源：Hsiao, C. H.，等。用于癌症治疗的细胞毒性细胞因子诱导杀伤性T细胞的分离与扩增。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频演示了一种 体外 一种用于评估细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）对癌细胞杀伤能力的技术。将靶向癌细胞与CIK细胞共培养后，利用荧光活率染料标记死亡的癌细胞，并通过流式细胞术进行定量，从而评估CIK细胞的细胞毒性效应。

方案

所有涉及人类受试者的研究程序均按照机构、国家及国际层面的人类福祉相关指南实施，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 材料准备

1. 按照材料安全数据表（MSDS）所示储存试剂、抗体和化学品。将药物或细胞因子溶解于适当的溶剂中配制成储备液，然后分装保存于 -20 °C 或 -80 °C。
   注意： 材料制备的详细信息见材料表。

2. 外周血单个核细胞（PBMC）的分离

1. 使用前将密度梯度溶液（材料表）预热至 18–20 °C。反复倒置溶液瓶数次，以确保充分混匀。
2. 采集 3−5 mL 人静脉血样本至含肝素的试管中，轻轻反复倒置试管数次，充分混匀。
3. 在 15 mL 无菌离心管中加入 4 mL 密度梯度溶液。
4. 小心地将 1 mL 血液样本叠加于密度梯度溶液上层。
5. 在 18−20 °C 条件下，以 400 × g 离心 30 分钟（关闭刹车）。
6. 立即用 1 mL 无菌移液器小心、一次性快速吸出约 1 mL 的单个核细胞白膜层，转移至另一无菌 15 mL 离心管中，避免扰动各层。
7. 向离心管中的白膜层加入至少 3 倍体积（约 3 mL）的磷酸盐缓冲液（PBS）。用无菌移液器轻轻吹打至少 3 次，使细胞重悬。
8. 在 18−20 °C 条件下，以 400 × g 离心 10 分钟。吸除上清液。
9. 用 5 mL 基础培养基（材料表）重悬细胞沉淀，并转移至培养瓶中。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的细胞培养孵箱中进行培养。

3. CIK 细胞的诱导与扩增

1. 第0天，在含1,000 IU/mL IFN-γ的新鲜基础培养基中培养PBMCs（1 × 10⁶），置于37 °C、5% CO₂的加湿细胞培养箱中孵育24小时。
2. 第1天，更换为含50 ng/mL抗CD3抗体、1 ng/mL重组人（rh）IL-1α和1,000 U/mL rh IL-2的新鲜基础培养基。每3天更换一次培养基。
3. 第7天，更换为含1,000 U/mL rh IL-2的新鲜基础培养基。此后每3天更换一次培养基，直至细胞扩增结束（第14天）。

4. CIK 细胞免疫表型分析评估

1. 用 10 mL 无菌 PBS 洗涤 CIK 细胞。在 300 × g 和 18−20 °C 条件下离心 10 分钟，吸除上清液，再用 10 mL PBS 重悬细胞。用台盼蓝排斥法计数细胞数量并检测细胞活力。
2. 将 CIK 细胞分装至六个无菌的 1.5 mL 离心管中，每管细胞密度约为 ~5–10 × 10⁵ 个细胞/mL PBS。标记各管并按如下处理：第 1 管，空白对照（不加抗体）；第 2 管，加入 20 µL 同型对照 IgG1-FITC；第 3 管，加入 20 µL 同型对照 IgG1-APC 单克隆抗体；第 4 管，加入 20 µL CD3-FITC；第 5 管，加入 20 µL CD56-APC 单克隆抗体；第 6 管，加入 20 µL CD3-FITC 和 20 µL CD56-APC 单克隆抗体。
3. 用 1 mL 无菌移液器轻轻吹打至少 3 次，使 CIK 细胞与抗体充分混匀，然后在室温避光孵育 30 分钟。
4. 在 300 × g 和 18−20 °C 条件下离心 10 分钟。吸除上清液，用 1 mL PBS 重悬细胞沉淀。用 1 mL 无菌移液器轻轻吹打至少 3 次。
5. 重复步骤 4.4。
6. 流式细胞术分析前，将各管置于避光环境中。

5. CD 标记物识别

1. 用移液器轻轻将细胞悬液通过滤帽转移至无菌的5 mL聚苯乙烯圆底管中（滤帽孔径为100 μm）。将试管按顺序放置在进样架上。
2. 打开流式细胞仪分析软件，创建一个实验文件夹。点击新建样本按钮，向实验中添加样本和试管，并按以下方式命名试管：试管1，空白；试管2，同型对照IgG1-CD3；试管3，同型对照IgG1-CD56；试管4，CD3；试管5，CD56；试管6，CD3CD56。
3. 为CIK细胞群体建立散点图门控系统（图1A）。
   1. 选择试管1（空白），点击散点图按钮，生成FSC-A/SSC-A图。在FSC-A阈值>5 x 10⁴的条件下，围绕整个细胞群体绘制矩形门，以排除细胞碎片。
   2. 为新散点图选择SSC-A/SSC-H参数，并围绕所有单细胞绘制多边形门。分别为新直方图选择Count/FITC (CD3)和Count/APC (CD56)参数。为新散点图选择FITC (CD3)/APC (CD56)参数，并绘制四象限门以定义四个亚群。
   3. 记录每个样本中20,000个单细胞的数据。点击加载样本按钮，首先分析空白对照样本。利用CD56和CD3通道参数识别完整的CIK细胞群体。
4. 对所有样本的检测重复步骤5.3。
5. 打开包含各样本统计数值的文件，用于分析CIK细胞群体，并将其重新导出至分析文件中。

6. 人慢性髓性白血病K562细胞和卵巢癌OC-3细胞的培养与染色

1. K562 细胞
   1. 在细胞培养瓶中，将K562细胞接种于完全培养基（含10%胎牛血清[FBS]、50 U/mL抗生素的RPMI基础培养基，并将葡萄糖浓度调整至4.5 g/L）中，细胞密度为0.5−1 × 10⁶ 个细胞/mL，于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养₂.
   2. 将含有 K562 细胞的培养基转移至 50 mL 无菌离心管中，在 300 x g 在实验当天，于18−20 °C条件下孵育10分钟。
   3. 吸去上清液，将细胞重悬于5 mL无菌PBS中，并轻轻混匀。
   4. 300 x g 离心收集细胞 g 10分钟。吸除上清液，用PBS重悬细胞，并将K562细胞调整至浓度为0.5-1 x 10⁶ cells/mL
   5. 在15 mL无菌管中，向1 mL K562细胞悬液加入0.5 µL羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染料，终浓度为5 μM。用移液器轻轻吹打混匀，至少上下吹打3次。
   6. 将试管置于37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中₂ 10–15 分钟。
   7. 向离心管中加入 9 mL PBS，300 x g 离心收集细胞 g 孵育10分钟。倾去上清液，然后将细胞沉淀重悬于10 mL完全培养基中。将细胞悬液转移至细胞培养瓶，放入培养箱中培养。
2. OC-3 细胞
   1. 在完全培养基（含10% FBS和50 U/mL抗生素的DMEM/F12培养基）中培养OC-3细胞，细胞密度为0.5–1 × 10⁶ 细胞培养瓶中的细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养₂.
   2. 实验前一天吸除培养基，并用PBS洗涤细胞。
   3. 加入1 mL细胞解离酶溶液，使细胞脱落材料列表）并在37 °C下孵育5分钟。
   4. 加入5 mL PBS重悬细胞，轻轻混匀。在300 x g条件下离心收集细胞沉淀。 g 10分钟，吸除上清液。用PBS重悬细胞，并将细胞浓度调整为0.5–1 × 10⁶ cells/mL
   5. 在15 mL无菌管中，向1 mL OC-3细胞悬液加入0.5 µL CFSE染料，终浓度为5 μM。用移液器轻轻吹打混匀，至少上下吹打3次。
   6. 将试管置于37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中₂ 10–15 分钟。
   7. 向离心管中加入 9 mL PBS，以 300 x g 离心收集细胞 g 10分钟。倾去上清液，然后用完全培养基重悬细胞沉淀。接种5 x 10⁵ 将细胞接种至6孔板中，每孔接种量为细胞/孔，在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育₂ 过夜。

7. 细胞毒性检测

1. CIK细胞与K562细胞共培养（CIK-K562）
   1. 从步骤6.1.7中计数K562细胞，并通过台盼蓝排斥法检测细胞活力。以5 × 10⁵个/mL的密度，向6孔板的每个孔中加入1 mL K562细胞⁵/mL
   2. 向7.1.1步骤中的6孔板中加入1 mL基础培养基，培养基中含或不含3.4步骤的CIK细胞，具体分组如下：第1孔 = 空白对照，仅K562细胞（5 × 10⁵）⁵）；2号孔 = 仅CFSE染色的K562细胞（5 x 10⁵）；第3孔 = CIK细胞（效应细胞[E]，25 × 10⁵) + CFSE标记的K562细胞（T[靶细胞]，5 × 10⁵）；第4孔＝CIK细胞（E，50 × 10⁵) + CFSE 标记的 K562 细胞（T，5 x 10⁵).
   3. 轻轻吹打细胞悬液至少3次以混匀。将培养板放入培养箱中孵育24小时。
2. CIK细胞与OC-3细胞共培养（CIK-OC-3）
   1. 向6.2.7步骤中的6孔板中加入1 mL基础培养基，培养基中含或不含3.4步骤的CIK细胞，具体如下：第1孔 = 空白对照，仅OC-3细胞（5 × 10⁵）；第2孔 = 仅CFSE标记的OC-3细胞（5 × 10⁵）⁵）；3号孔＝CIK细胞（E，25 × 10⁵) + CFSE 标记的 OC-3 细胞（T，5 × 10⁵）；第4孔＝CIK细胞（E，50 × 10⁵) + CFSE 标记的 OC-3 细胞（T，5 × 10⁵).
   2. 轻轻吹打细胞悬液，至少3次。将培养板放入培养箱中孵育24小时。
3. 7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色
   1. 将第7.1.3步的CIK-K562细胞悬液直接收集至15 mL无菌离心管中。
   2. 收集第7.2.2步中CIK-OC-3组的悬浮细胞和贴壁细胞。
      1. 将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中。用1 mL无菌PBS洗涤孔，收集PBS并加入该离心管中。加入0.5 mL细胞解离酶溶液，于37 °C孵育5分钟。
      2. 向对应孔中加入同一管中的1 mL溶液，并使用1 mL无菌移液器轻轻吹打细胞至少3次，以混匀细胞。将所有细胞收集至同一管中。
   3. 以 300 x g 离心 g 孵育10分钟，吸除上清液，将细胞重悬于1 mL无菌PBS中。以300 x g 孵育10分钟，吸除上清液，将细胞重悬于100 µL无菌PBS中。
   4. 加入5 µL 7-AAD染料（50 ng/µL储存液）至细胞悬液中。使用1 mL无菌移液器轻轻吹打细胞至少3次以混匀。避光孵育10分钟，然后进行分析。
4. 细胞溶解能力检测
   1. 混合步骤 7.3.4 中的细胞悬液，并重复步骤 5.1 和 5.2 一次。
   2. 点击 新样本 点击按钮将样本和试管添加至实验，并按以下方式命名试管：1号管，仅K562（或OC-3）细胞；2号管，仅CFSE染色的K562（或OC-3）细胞；3号管，效靶比E:T = 5:1；4号管，效靶比E:T = 10:1。
   3. 创建细胞毒实验的散点图门控系统（图2A).
      1. 选择试管1并点击 点图 点击按钮创建 FSC-A/SSC-A 图。在所有事件上绘制一个矩形门，设定 FSC-A 阈值 >5 × 10⁴ 以排除细胞碎片。
      2. 选择 SSC-A/CFSE 新点图的参数。选择 7-AAD/CFSE 为新的点图设置参数，并绘制四象限门以界定四个亚群。
      3. 点击 上样 首先分析空白对照样本的按钮。
      4. 调整SSC-A和FSC-A的电压。利用CFSE和7-AAD通道参数识别死细胞群体。记录数据 >每份标本中 20,000 个 CFSE+ 细胞。
   4. 对所有标本的检测重复第7.4.6节步骤。
   5. 打开包含每个样本统计值的文件，以分析非活细胞群体，并将数据导出至分析文件中。

结果

图1：一名代表性外周血单个核细胞（PBMC）样本中 CD3⁺CD56⁺ T 细胞的比例。（A）通过特定的细胞大小和颗粒度特征识别淋巴细胞。选择单细胞群体用于流式细胞术分析。（B）采用t检验对三名健康供体的CIK细胞扩增效率进行统计学分析（*, p < 0.01）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7-氨基放线菌素 D	BD	559925
APC 标记小鼠抗人 CD56 抗体	BD	555518	B159
APC 标记小鼠 IgG1, κ 同型对照	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II 流式细胞仪	BD	338962		序列号：R33896202856
羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）	BD	565082		将 CFSE 染料（500 mg）用 90 mL DMSO 重悬
D-(+)-葡萄糖溶液	SIGMA	G8644		用于 K562 细胞培养。向 500 mL 完全培养基中加入 12.5 mL
DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基/F12）	HyClone	SH30023.02		OC-3 细胞培养的基础培养基
胎牛血清	HyClone	SH30084.03		用于 K562 和 OC-3 细胞培养。完全培养基中含 10% 胎牛血清
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		密度梯度溶液
FITC 标记小鼠抗人 CD3 抗体	BD	555332	UCHT1
FITC 标记小鼠 IgG1, κ 同型对照	BD	555748	MOPC-21
人抗 CD3 单克隆抗体	TaKaRa	T210	OKT3	将 2.5 mL 储存液（1 mg/1 mL）加入 50 mL 诱导培养基中。储存液保存于 -80 °C
青霉素-链霉素	Gibco	15140122		将 5 mL 储存液（10,000 U/mL）加入 500 mL 完全培养基中。储存液保存于 4 °C
Proleukin	NOVARTIS			将 Proleukin 冻干粉（22×10⁶ IU）用 1.2 mL 无菌水重悬，取 2.7 mL 加入 50 mL 诱导培养基中。储存液保存于 -20 °C
重组人干扰素-γ	CellGenix	1425-050		将 rh IFN-γ（5×10⁵ IU/50 µg）用 200 µL 无菌水重悬，取 20 mL 加入 50 mL 诱导培养基中。储存液保存于 -20 °C
重组人白细胞介素-1α	PEPROTECH	200-01A		将 rh IL-1α（10 µg）用 1 mL 无菌水重悬，取 5 mL 加入 50 mL 诱导培养基中。储存液保存于 -20 °C
RPMI1640 培养基	Gibco	11875-085		K562 细胞培养的基础培养基。储存液保存于 4 °C
Sigma 3-18K 离心机	Sigma	10295
TrypLE Express 酶	Gibco	12605028		细胞解离酶；用于贴壁细胞的消化。室温保存
X-VIVO 15 培养基	Lonza	04-418Q		PBMC 和 CIK 细胞的基础培养基。保存于 4 °C