来源：Hsiao, C. H.，等。用于癌症治疗的细胞毒性细胞因子诱导杀伤性T细胞的分离与扩增。J. Vis. Exp. (2020)。
本视频演示了一种 体外 一种用于评估细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）对癌细胞杀伤能力的技术。将靶向癌细胞与CIK细胞共培养后，利用荧光活率染料标记死亡的癌细胞，并通过流式细胞术进行定量，从而评估CIK细胞的细胞毒性效应。
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方法文章
一种体外检测细胞因子诱导杀伤细胞细胞毒性的实验方法
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及人类受试者的研究程序均按照机构、国家及国际层面的人类福祉相关指南实施，并已通过当地机构审查委员会的审核。
1. 材料准备
- 按照材料安全数据表（MSDS）所示储存试剂、抗体和化学品。将药物或细胞因子溶解于适当的溶剂中配制成储备液，然后分装保存于 -20 °C 或 -80 °C。
注意： 材料制备的详细信息见材料表。
2. 外周血单个核细胞（PBMC）的分离
- 使用前将密度梯度溶液（材料表）预热至 18–20 °C。反复倒置溶液瓶数次，以确保充分混匀。
- 采集 3−5 mL 人静脉血样本至含肝素的试管中，轻轻反复倒置试管数次，充分混匀。
- 在 15 mL 无菌离心管中加入 4 mL 密度梯度溶液。
- 小心地将 1 mL 血液样本叠加于密度梯度溶液上层。
- 在 18−20 °C 条件下，以 400 × g 离心 30 分钟（关闭刹车）。
- 立即用 1 mL 无菌移液器小心、一次性快速吸出约 1 mL 的单个核细胞白膜层，转移至另一无菌 15 mL 离心管中，避免扰动各层。<....
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结果
图1：一名代表性外周血单个核细胞（PBMC）样本中 CD3+CD56+ T 细胞的比例。（A）通过特定的细胞大小和颗粒度特征识别淋巴细胞。选择单细胞群体用于流式细胞术分析。（B）采用t检验对三名健康供体的CIK细胞扩增效率进行统计学分析（*, p < 0.01）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 7-氨基放线菌素 D | BD | 559925 | ||
| APC 标记小鼠抗人 CD56 抗体 | BD | 555518 | B159 | |
| APC 标记小鼠 IgG1, κ 同型对照 | BD | 555751 | MOPC-21 | |
| BD FACSCanto II 流式细胞仪 | BD | 338962 | 序列号：R33896202856 | |
| 羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE） | BD | 565082 | 将 CFSE 染料（500 mg）用 90 mL DMSO 重悬 | |
| D-(+)-葡萄糖溶液 | SIGMA | G8644 | 用于 K562 细胞培养。向 500 mL 完全培养基中加入 12.5 mL | |
| DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基/F12） | HyClone | SH30023.02 | OC-3 细胞培养的基础培养基 | |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30084.03 | 用于 K562 和 OC-3 细胞培养。完全培养基中含 10% 胎牛血清 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | 密度梯度溶液 | |
| FITC 标记小鼠抗人 CD3 抗体 | BD | 555332 | UCHT1 | |
| FITC 标记小鼠 IgG1, κ 同型对照 | BD | 555748 | MOPC-21 | |
| 人抗 CD3 单克隆抗体 | TaKaRa | T210 | OKT3 | 将 2.5 mL 储存液（1 mg/1 mL）加入 50 mL 诱导培养基中。储存液保存于 -80 °C |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 将 5 mL 储存液（10,000 U/mL）加入 500 mL 完全培养基中。储存液保存于 4 °C | |
| Proleukin | NOVARTIS | 将 Proleukin 冻干粉（22×10⁶ IU）用 1.2 mL 无菌水重悬，取 2.7 mL 加入 50 mL 诱导培养基中。储存液保存于 -20 °C | ||
| 重组人干扰素-γ | CellGenix | 1425-050 | 将 rh IFN-γ（5×10⁵ IU/50 µg）用 200 µL 无菌水重悬，取 20 mL 加入 50 mL 诱导培养基中。储存液保存于 -20 °C | |
| 重组人白细胞介素-1α | PEPROTECH | 200-01A | 将 rh IL-1α（10 µg）用 1 mL 无菌水重悬，取 5 mL 加入 50 mL 诱导培养基中。储存液保存于 -20 °C | |
| RPMI1640 培养基 | Gibco | 11875-085 | K562 细胞培养的基础培养基。储存液保存于 4 °C | |
| Sigma 3-18K 离心机 | Sigma | 10295 | ||
| TrypLE Express 酶 | Gibco | 12605028 | 细胞解离酶；用于贴壁细胞的消化。室温保存 | |
| X-VIVO 15 培养基 | Lonza | 04-418Q | PBMC 和 CIK 细胞的基础培养基。保存于 4 °C |
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