人肠上皮类器官模型中坏死性小肠结肠炎的诱导

摘要

来源：Ares, G. J.，等。一种新型的人类上皮类肠器官坏死性小肠结肠炎模型。J. Vis. Exp.(2019)。

本视频展示了在人源性新生儿肠类器官模型中，通过脂多糖处理诱导坏死性小肠结肠炎疾病的发生过程。该模型有助于研究肠道病理生理学。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 试剂准备

1. 准备用于完整组织采集的培养基储备液：1 L 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、110 mL 胎牛血清（FBS）、11 mL 青霉素-链霉素（终浓度 1%）和 1.1 mL 过滤除菌的胰岛素（终浓度 0.1%）。将储备液储存于 4 °C。
2. 准备螯合缓冲液 #1：30 mL 培养基（如步骤 1.1 所述）、600 µL 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）（终浓度 10 mM）、300 µL 庆大霉素（终浓度 1%）和 60 µL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）。将储备液储存于 4 °C。
3. 准备螯合缓冲液 #2：30 mL 培养基（如步骤 1.1 所述）、300 µL 0.5 M EDTA（终浓度 5 mM）、300 µL 庆大霉素（终浓度 1%）和 60 µL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）。将储备液储存于 4 °C。
4. 准备人源类肠道培养基：41.4 mL DMEM/F-12、5 mL FBS（终浓度 10%）、500 µL 青霉素-链霉素（终浓度 1%）、500 µL L-谷氨酰胺（终浓度 1%）、500 µL 庆大霉素（终浓度 1%）、100 µL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）、500 µL 1 M N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）（终浓度 10 mM）、500 µL 100x N-2 补充剂和 1 mL 50x B-27 补充剂（不含维生素 A），总体积为 50 mL。将储备液储存于 -20 °C。
5. 准备完全人源类肠道培养基：10 mL 人源类肠道培养基（按步骤 1.4 制备）、10 µL 100 µg/mL Wnt3a（终浓度 100 ng/mL）、10 µL 100 µg/mL Noggin（终浓度 100 ng/mL）、10 µL 1 mg/mL R-Spondin（终浓度 1 µg/mL）、10 µL 500 µg/mL 表皮生长因子（EGF）（终浓度 50 ng/mL）、10 µL 1 M N-乙酰半胱氨酸（终浓度 1 mM）、10 µL 10 mM Y-27632（终浓度 10 µM）、10 µL 500 µM A-83（终浓度 500 nM）、10 µL 10 mM SB202190（终浓度 10 µM）、100 µL 1 M 烟酰胺（终浓度 10 mM）和 1 µL 100 µM [leu] 15-胃泌素 1（终浓度 10 nM）。总体积为 10 mL。将储备液储存于 4 °C。
   注意：溶液必须在 48 小时内使用完毕。

2. 从完整组织中分离和接种隐窝

1. 在手术室采集样本时，将人小肠组织样本置于冰冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中。用冷DPBS清洗样本，直至去除粪便和血液残留。将样本在4 °C下保存于RPMI 1640培养基中，待进行隐窝分离时使用。
   注意： 组织保存时间不得超过24小时。
   1. 确保标本无粪便和血液残留。使用精细的解剖剪去除多余的脂肪、手术夹/钉等异物。称量标本重量。
      ​注意： 目标组织块质量约为0.75–2.5 g。
2. 将样本切成0.5 cm的片段，放入30 mL螯合缓冲液#1（按步骤1.2配制）中。
   1. 4 °C下低速振荡15分钟。
   2. 用100 µm细胞滤网过滤组织，弃去滤液。
3. 将组织加入 30 mL 螯合缓冲液 #2（按步骤 1.3 配制）。
   1. 4 °C下低速振荡15分钟。
   2. 通过100 µm细胞滤筛过滤组织，弃去滤过液。
4. 在冰上解冻500 mL基底膜基质，用于步骤2.8。
5. 将组织加入含有10 mL冷DMEM的50 mL锥形管中，用手剧烈振荡10秒。
   1. 通过100 µm细胞滤网过滤，收集滤过液（标签#1）。将1号管置于冰上保存。
   2. 将组织加入另一含有10 mL冷DMEM的50 mL锥形管中，用手剧烈振荡10秒。
   3. 通过100 µm细胞滤网过滤，收集滤过液（标记为#2）。
   4. 重复此步骤两次，共得到四支含有流穿液的锥形管（分别标记为管#1–4）。
6. 将滤管 #1 中的溶液经 100 µm 细胞滤网过滤，收集滤过液至 15 mL 圆锥管中（标记为 #1）。对 #2–4 重复此步骤。
   1. 离心15 mL离心管#1-4，200 x g 4 °C下离心15分钟。
7. 在超净工作台中，移除第1至4号管的上清液并弃去。避免扰动沉淀物上方的组织云状物，即使这意味着需保留部分上清液。
   1. 用移液器缓慢吹打，将第1-4号管中沉淀与残留的上清液混合均匀。
   2. 将第1至第4号管中的混合物转移至一个2 mL锥形管中。
   3. 将锥形管在 200 x g 4 °C下持续20分钟
8. 移除上清液，将沉淀物重悬于500 µL基底膜基质中。
   注意： 始终将基底膜基质置于冰上，并迅速进行后续步骤。该产品在室温下会迅速聚合。
   1. 将50 µL样本/基底膜基质悬液加入24孔板中一个孔的中央，应呈现圆顶状。
      注意： 使用预冷的移液器吸头有助于更顺畅地转移悬浮液，减少聚合反应的发生。
   2. 重复9次，共填充10个孔。
9. 将24孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟，以使聚合反应进行。
10. 向每个孔中加入500 µL人源类肠道完全培养基（按步骤1.5制备）。每2天更换一次。
11. 在观察到出芽后5-10天收集类肠体。收集操作说明见步骤4和步骤5。

3. 实验性坏死性小肠结肠炎的诱导

1. 在第0天，向每个孔中的500 µL人源类肠器官完全培养基（按步骤1.5制备）中加入10 µL浓度为5 mg/mL的脂多糖（LPS）。每2天更换一次，直至收样。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛	ThermoFisher	AAJ19943K2
基底膜基质（Matrigel）	Corning	CB-40230C
DMEM/F-12	ThermoFisher	MT-16-405-CV
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	ThermoFisher	11-965-118
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	ThermoFisher	14190-144
表皮生长因子（EGF）	Sigma	E9644-.2MG
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma	EDS-500G
胎牛血清（FBS）	Gemini Bio-Pro	100-125
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P5368-5X10PAK
RPMI 1640 培养基	Invitrogen	11875093
组织处理胶（Histogel）	ThermoFisher	22-110-678
脂多糖（LPS）	Sigma	L2630-25MG
庆大霉素	Sigma	G5013-1G