在人上皮小肠样模型中诱导坏死性小肠结肠炎

Abstract

来源:Ares， G. J. et al. 坏死性小肠结肠炎的新型人上皮肠样模型。J. Vis. Exp.（2019 年）。

该视频演示了脂多糖治疗诱导的人源性新生儿肠样模型中坏死性小肠结肠炎疾病的发展。该模型有助于研究肠道病理生理学。

Protocol

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 试剂制备

1. 准备用于整个组织收集的培养基储备溶液:1 L Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）、110 mL 胎牛血清 （FBS）、11 mL 青霉素-链霉素（终浓度 1%）和 1.1 mL 过滤灭菌胰岛素（终浓度 0.1%）。将储备溶液储存在4°C。
2. 准备螯合缓冲液 #1:30 mL 培养基（如 1.1 中所述）、600 μL 0.5 M 乙二胺四乙酸 （EDTA）（终浓度 10 mM）、300 μL 庆大霉素（终浓度 1%）和 60 μL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）。将储备溶液储存在4°C。
3. 准备螯合缓冲液 #2:30 mL 培养基（如 1.1 中所述）、300 μL 0.5 M EDTA（终浓度 5mM）、300 μL 庆大霉素（终浓度 1%）和 60 μL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）。将储备溶液储存在4°C。
4. 制备人小肠培养基:41.4 mL DMEM/F-12、5 mL FBS（最终 10%）、500 μL 青霉素-链霉素（最终浓度 1%）、500 μL L-谷氨酰胺（最终浓度 1%）、500 μL 庆大霉素（最终浓度 1%）、100 μL 两性霉素 B（最终浓度 0.2%）、500 μL 1 M N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸 （HEPES）（最终浓度 10 mM）， 500 μL 100x N-2 补充剂和 1 mL 50x B-27 补充剂（不含维生素 A），总体积为 50 mL。将储备溶液储存在 -20 °C。
5. 制备人 Minigut 培养基完整版:10 mL 人 Minigut 培养基（以 1.4 配制）、10 μL 100 μg/mL Wnt3a（终浓度 100 ng/mL）、10 μL 100 μg/mL Noggin（终浓度 100 ng/mL）、10 μL 1 mg/mL R-Spondin（终浓度 1 μg/mL）、 10 μL 500 μg/mL 表皮生长因子 （EGF）（终浓度 50 ng/mL），10 μL 1 M N-乙酰半胱氨酸（终浓度 1 mM），10 μL 10 mM Y-27632（终浓度 10 μM），10 μL 500 μM A-83（终浓度 500 nM），10 μL 10 mM SB202190（终浓度 10 μM）， 100 μL 1 M 烟酰胺（终浓度 10 mM）和 1 μL 100 μM [leu] 15-胃泌素 1（终浓度 10 nM）。总体积 10 mL。将储备溶液储存在 4 °C.
   注意: 溶液必须在 48 小时内使用。

2. 从整个组织中分离和接种隐窝

1. 在手术室中采集时，将人小肠组织样本置于冷的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中。在冷 DPBS 中清洗标本，直到粪便和血液清除。将样品储存在 4 °C 的 RPMI 1640 培养基中，直到准备好进行隐窝分离><。 注意:组织不能储存超过 24 小时。
   1. 确保标本没有粪便和血液。使用精致的解剖剪刀，去除多余的脂肪或手术夹/订书钉等。称量试样。
      注意:目标是大约 0.75-2.5 克的一块。
2. 将标本切成 0.5 cm 的小块，放入 30 mL 的螯合缓冲液 #1 中（如步骤 1.2 中制备的）。
   1. 在 4 °C 下低速摇动 15 分钟。
   2. 通过 100 μm 细胞过滤器过滤组织并丢弃流出物。
3. 将组织添加到 30 mL 螯合缓冲液 #2 中（如步骤 1.3 中制备的）。
   1. 在 4 °C 下低速摇动 15 分钟。
   2. 通过 100 μm 细胞过滤器过滤组织并丢弃流出物。
4. 在冰上解冻 500 mL 基底膜基质，用于步骤 2.8。
5. 将组织添加到 50 mL 锥形管中的 10 mL 冷 DMEM 中，然后用手剧烈摇晃 10 秒。
   1. 通过 100 μm 细胞过滤器过滤并收集流出物（标签 #1）。将管 #1 放在冰上。
   2. 将组织加入到另一个 50 mL 锥形管中的另外 10 mL 冷 DMEM 中，用手剧烈摇晃 10 秒钟。
   3. 通过 100 μm 细胞过滤器过滤并收集流出物（标签 #2）。
   4. 再重复两次，直到有四个流过的锥形管（标记为 #1-4 的管）。
6. 过滤管 #1 溶液通过 100 μm 细胞过滤器，并将液流转移到 15 mL 锥形管（标签 #1）中。对 #2-4 重复上述步骤。
   1. 在 4 °C 下以 200 x g 离心 15 mL 管 #1-4 15 分钟。
7. 在层流罩中，从管 #1-4 中取出上清液并丢弃。避免破坏沉淀正上方的组织云，即使这意味着留下一些上清液。
   1. 通过缓慢移液，将沉淀与管 #1-4 中剩余的上清液混合在一起。
   2. 将混合物从试管 #1-4 转移到一个 2 mL 锥形管中。
   3. 将锥形管在 4 °C 下以 200 x g 离心 20 分钟。
8. 去除上清液，将沉淀重新悬浮在 500 μL 基底膜基质中><。 注意:始终将基底膜基质放在冰上，并快速进行下一步。该产品在室温下聚合非常快。
   1. 将 50 μL 样品/基底膜基质悬液涂在 24 孔板的孔中心。这应该显示为圆顶形。
      注意: 使用冷冻移液器吸头有助于更顺畅地转移悬浮液，最大限度地减少聚合。
   2. 重复 9 次以填充总共 10 个孔。
9. 将 24 孔板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中 30 分钟以允许聚合。
10. 向每个孔中加入 500 μL 人 Minigut 培养基 Complete（如步骤 1.5 中制备的）。每 2 天更换一次。
11. 5-10 天后收集类肠杆菌，此时可以看到出芽。有关收集说明，请参阅步骤 4 和 5。

3. 实验 NEC 的诱导

1. 第 0 天，在每个孔中加入 10 μL 5 mg/mL 脂多糖 （LPS） 到 500 μL 人 Minigut 培养基 Complete（如步骤 1.5 中制备的）中。每 2 天更换一次，直到收集。

Materials