体外粘附实验检测癌细胞对中性粒细胞胞外诱捕网的粘附

摘要

Najmeh, S.，等。简化的人中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的分离与处理方法。J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们演示了一种利用荧光显微镜检测癌细胞与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）黏附的实验方法。在测试孔中，可观察到荧光标记的癌细胞黏附于NETs的数量显著增加；而在经DNase处理的孔中，癌细胞对NETs的黏附则明显减少。

方案

1. NET-肿瘤细胞静态黏附实验

1. 在96孔平底板中每孔加入100 μl先前获得的NET原液，于4 °C避光条件下过夜包被。
2. 12至20小时后，在显微镜下检查各孔底部是否形成均匀的无细胞NET单层（图1）。此时，轻柔吸去所有未结合的物质，注意不要破坏孔底的NET单层。
3. 每孔加入100 μl 1%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温孵育1小时。
4. 使用2 ml 0.25%胰蛋白酶溶液从T-75培养瓶中消化A549癌细胞。细胞脱落后，向细胞悬液中加入10 ml A549培养基，于4 °C以450 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于培养基中，调整浓度至每100 μl培养基含2 × 10⁴个癌细胞。
   注意：A549细胞为单独培养。简言之，细胞在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM F12培养基中培养并维持，于37 °C、5% CO₂条件下孵育。当细胞融合度达到70–80%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，并重悬于上述相同培养基中。
5. 使用CFSE对癌细胞进行染色：每毫升培养基中加入1 μl CFSE，室温避光染色10分钟。染色后，于4 °C以450 × g离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于初始体积的培养基中，调整浓度至每100 μl培养基含2 × ....

结果

图1. NET单层结构。 涂有NETs的96孔板孔的光学显微镜图像显示，（A）孔内形成连续均匀的NETs单层，而（B）孔的涂层不充分，NETs层出现中断。比例尺为40 μm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含氯化钙和氯化镁的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）改良型	Wisent	311-425-CL
含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基	Wisent	350-000-CL	3% RPMI溶液通过在RPMI中添加3%胎牛血清制备
BD Pharm Lyse 溶血缓冲液	BD Biosciences	555899
DNAse1	Roche	11284932001
F12 DMEM	Wisent	319-075-CL
胎牛血清（FBS）	Wisent	080-150
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
CFSE	Invitrogen	C1157
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056