细菌细胞染色及免疫学研究样品制备

摘要

来源：Yang, J. 等，细菌黏附宿主细胞的自动化高通量检测 J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了使用红色荧光染料对细菌细胞进行染色及制备，以用于免疫学研究。将染色后的细菌稀释并重悬于培养基中，以获得用于感染宿主细胞所需的细菌浓度，即感染复数。

方案

1. 细菌培养与染色

1. 在生物安全二级实验室的生物安全柜中进行所有细菌实验操作。
2. 接种所有细菌培养物，包括 铜绿假单胞菌 (PAO1) 大肠杆菌, 单核细胞增生李斯特菌，  枯草芽孢杆菌， 等等， 从冻存的甘油菌种中接种，在3 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，于37 °C、250 rpm振荡培养过夜。
3. 第二天，用1:100的稀释比例将过夜培养物接种至子培养物中，在TSB（1 mL）中培养3小时至对数生长期，测定600 nm处的光密度（OD600）₆₀₀) 以确认。 确保 OD₆₀₀ 在0.4-0.6范围内.
4. 在进行细菌-宿主黏附实验之前，将细菌悬液在TSB琼脂平板上进行系列稀释，于37 °C过夜培养，然后根据菌落数量确定细菌的菌落形成单位（CFUs）。对于 P. aeruginosa，一个OD₆₀₀ 1.0 对应于 2 × 10⁸ 可存活细菌细胞/mL，以及 单核细胞增生李斯特菌，一个OD₆₀₀ 1.0 对应于 9 × 10⁸ 可存活的细菌细胞/mL
5. 在指数生长期通过13,000 x g离心收集细菌培养物 g 室温（RT）孵育2分钟，然后用1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。将细菌沉淀重悬于1 mL 1×PBS中，通过测定OD值确定浓度₆₀₀ 细菌悬液的制备。例如， P. aeruginosa OD值₆₀₀ 0.5 表示浓度为 1 × 10⁸ 细菌细胞/毫升
6. 在室温下，将细菌悬液与绿色或红色荧光染料避光孵育30分钟，同时轻轻旋转染色。具体操作为：向1 mL细菌悬液中加入2 μL 500倍浓缩的染料原液，使染料终浓度为1倍稀释。为去除未结合的染料，将染色后的细菌在13,000 x g 2分钟，然后用1 mL 1×PBS重悬沉淀，重复三次。
   注意： 如果实验中使用了荧光蛋白标记的细菌（如绿色荧光蛋白（GFP-）、红色荧光蛋白（RFP-）、mCherry-等），则可跳过此细菌染色步骤。GFP标记的 P. aeruginosa 红色荧光染料染色的 L. monocytogenes 在本方案中使用了。
7. 通过在13,000 x g条件下离心收集染色的细菌细胞或GFP标记的细菌 g 2 分钟后，用新鲜的 F-12K 培养基（1 mL）重悬，并测定 OD₆₀₀ 每种培养物的后续稀释需根据感染复数（MOI）和宿主细胞浓度调整至所需浓度。本实验最终使用体积为500 μL。
   注意： 例如，若使用台盼蓝染色法计数的宿主细胞浓度为 1 x 10⁵ 细胞/mL，感染复数（MOI）为100时所需的目标细菌细胞浓度为1 × 10⁷ 细胞/mL。浓度 P. aeruginosa 在 0.5 OD 处₆₀₀ 是 1 × 10⁸/mL。为获得所需浓度，将 P. aeruginosa 将培养物稀释10倍，取50 μL重悬的培养物加入450 μL新鲜F-12K培养基中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS	VWR	45001-130
BactoView Live Red	Biotium	40101	细菌染色染料
离心机	Eppendorf	5810R
E. coli			实验室菌种
F-12k 培养基	ATCC	302004	A549 细胞培养基
胎牛血清	Corning	35-016-CV
L. monocytogenes			NIST 菌种库
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows 实验室菌种
P. aeruginosa ΔpilA			Dr. Lori Burrows 实验室菌种
S. agalactiae			NIST 菌种库
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST 菌种库
大豆肉汤培养基	Growcells	MBPE-4040