使用流式细胞术检测玻连蛋白与细菌表面的结合

Abstract

来源:Singh， B. et al.， 研究玻连蛋白在细菌粘附和血清耐药性中的作用的检测方法。J. Vis. Exp.（2018 年）

该视频演示了玻连蛋白与细菌表面蛋白相互作用的检测。流式细胞术分析可测量与玻连蛋白结合的荧光标记抗体的荧光信号，确认其存在于细菌表面。该技术提供了对宿主-病原体相互作用和潜在细菌感染疗法的见解。

Protocol

1. 玻连蛋白、Vn 作为细菌表面蛋白配体的分析

1. 使用流式细胞术检测细菌表面的 Vn 结合
   注意:在流式细胞术中，我们使用侧向散射和前向散射来设门阳性事件。为了检查与 Vn、流感嗜血杆菌 f 型、Hif 临床分离株 （n=10） 的相互作用，选择大肠杆菌 BL21 （DE3） 作为阴性对照（图 1A）。
   1. 在补充有 10 μg/mL 烟酰胺腺嘌二核苷酸 （NAD） 和血红素的脑心输注 （BHI） 培养基中培养 Hif 临床分离株，在 37 °C 下以 200 rpm 振荡。使用 Luria-Bertani 培养基培养大肠杆菌。在对数中期收获 Hif（光密度，OD₆₀₀ = 0.3），并将细菌重悬于磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，pH 7.2，含有 1% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA）（封闭缓冲液;PBS-BSA）。将悬浮液调整至 10⁹ 个菌落形成单位，CFU/mL。
   2. 将含有 5 x 10⁶ CFU 的等分试样转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管 （12 x 75 mm²） 中，并加入 1 mL 封闭缓冲液。在室温 （RT） 下以 3,500 × g 离心悬浮液 5 分钟以沉淀细菌，然后小心吸出以去除上清液，而不会干扰沉淀。
   3. 用 50 μL 含有 250 nM Vn 的封闭缓冲液重悬细菌沉淀，并在 RT 下孵育样品 1 小时而不摇晃。孵育后，通过以 3,500 x g 离心 5 分钟使细菌沉淀，然后使用 PBS 和类似的离心步骤洗涤沉淀 3 次。
   4. 向细菌沉淀中加入 50 μL 原代绵羊抗人 Vn 多克隆抗体 （pAbs），在 PBS-BSA 中以 1:100 稀释。将悬浮液在 RT 下孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤细菌 3 次以去除未结合的抗体（如步骤 1.1.3 中所述）。
   5. 接下来，加入 50 μL 含有异硫氰酸荧光素 （FITC） 共轭驴抗绵羊 pAb（1:100 稀释）的 PBS-BSA，并在 RT 下避光孵育 1 小时。
   6. 通过仅用封闭缓冲液孵育细菌和不使用 Vn 的 pAb 来制备空白对照。
   7. 用 1 mL 封闭缓冲液洗涤细菌 3 次，并通过离心沉淀悬浮液，如第 1.1.2 节所述。最后，用 300 μL PBS 重悬细菌沉淀，并通过流式细胞术进行分析。

Results

图 1:流感嗜血杆菌血清型 f 通过表面表达的 PH 结合 Vn。（A） 流式细胞术结果显示 Vn 与 Hif 临床分离株细胞的结合。将每种临床分离株 （5 x 10⁶ CFU） 与 250 nM 人 Vn 一起孵育。使用绵羊抗 Vn pAbs 和 FITC 偶联的驴抗绵羊二抗检测结合的配体。大肠杆菌 BL21 （DE3） 作为阴性对照。数据表示为三个独立实验中一式三份分析的平均荧光强度，误差线表示 SD。（B） 流式细胞术直方图显示 Vn 与 WT Hif M10 和 PH 缺失 Hif M10Δlph 突变体表面的结合。显示了来自三个独立实验之一的代表性数据。

Materials