使用流式细胞术检测玻璃连接蛋白与细菌表面的结合

摘要

来源：Singh, B. 等，研究连丝蛋白在细菌黏附和血清抗性中作用的实验方法。J. Vis. Exp. （2018）

本视频展示了玻连蛋白与细菌表面蛋白相互作用的检测方法。通过流式细胞术分析结合在玻连蛋白上的荧光标记抗体所产生的荧光信号，可确认玻连蛋白存在于细菌表面。该技术有助于理解宿主与病原体之间的相互作用，并为细菌感染的潜在治疗策略提供线索。

方案

1. 玻连蛋白（Vn）作为细菌表面蛋白配体的分析

1. 使用流式细胞术检测细菌表面的Vn结合
   注意：在流式细胞术中，我们使用侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）来圈定阳性事件。为研究与Vn的相互作用，选取了流感嗜血杆菌f型（Haemophilus influenzae type f）的10株临床分离株（Hif临床分离株），并以E. coli BL21 (DE3) 作为阴性对照（图1A）。
   1. 在补充有10 µg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和血红素的脑心浸液（BHI）培养基中，于37 °C、200 rpm振荡培养Hif临床分离株。使用LB培养基培养E. coli。在对数生长期中期收获Hif菌（光密度OD₆₀₀ = 0.3），用含1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）（封闭缓冲液；PBS-BSA）重悬细菌，并将菌液浓度调整至10⁹菌落形成单位（CFU）/mL。
   2. 将含5 × 10⁶ CFU的菌液分装至5 mL聚苯乙烯圆底试管（12 × 75 mm²）中，加入1 mL封闭缓冲液。在室温（RT）下以3,500 × g离心5 min使细菌沉淀，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
   3. 用50 μL含250 nM Vn的封闭缓冲液重悬细菌沉淀，在室温下避振孵育1 h。孵育后，在3,500 × g下离心5 min使细菌沉淀，随后用PBS洗涤沉淀3次，每次均采用相同的离心步骤。
   4. 向细菌沉淀中加入50 μL以PBS-BSA按1:100稀释的羊抗人Vn多克隆抗体（pAbs），在室温下孵育1 h，然后用PBS洗涤细菌3次，以去除未结合的抗体（操作同步骤1.1.3）。
   5. 随后，加入50 μL含异硫氰酸荧光素（FITC）标记的驴抗羊pAbs（1:100稀释）的PBS-BSA，在室温避光孵育1 h。
   6. 设置空白对照：将细菌仅与封闭缓冲液以及pAbs（不含Vn）共同孵育。
   7. 用1 mL封闭缓冲液洗涤细菌3次，并按步骤1.1.2所述方法离心收集菌体。最后，用300 µL PBS重悬细菌沉淀，并通过流式细胞术进行分析。

结果

图 1： Haemophilus influenzae f 血清型通过表面表达的 PH 结合 Vn。 （A）流式细胞术结果显示 Hif 临床分离株对 Vn 的结合。每个临床分离株（5 × 10⁶ CFU）与 250 nM 人 Vn 共孵育。结合的配体使用羊抗 Vn 多克隆抗体和 FITC 标记的驴抗羊二抗进行检测。Escherichia coli BL21 (DE3) 作为阴性对照。数据来自三次独立实验中每组三次重复分析的平均荧光强度，误差线表示标准差（SD）。（B）流式细胞术直方图显示 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL 聚苯乙烯圆底管	BD Falcon	60819-138	12 × 75 mm 型
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2058	适用于细胞培养
流式细胞仪	BD Biosciences	651154	用于科研应用的细胞分析级
人血浆来源的玻璃粘连蛋白（Vn）	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	细胞培养级
E. coli 宿主（E. Coli BL21）	Novagen	69450-3	蛋白表达宿主
异硫氰酸荧光素（FITC）标记的驴抗羊抗体	AbD Serotec	STAR88F	多克隆
羊抗人 Vn 抗体	AbD Serotec	AHP396	多克隆